过度训练对大鼠骨骼肌炎性因子和氧化应激相关基因表达的影响

肖卫华陈佩杰 朱琳

1上海体育学院运动科学学院（上海200438）

2湘南学院体育系 3广州体育学院运动与健康系

骨骼肌功能状态是决定运动成绩的关键因素之一，而骨骼肌炎症水平是影响骨骼肌功能状态的重要方面。骨骼肌细胞及骨骼肌中的免疫细胞可产生多种促炎因子和抑炎因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素 1β（IL-1β）、白介素 10（IL-10）、受激活调节正常T细胞表达和分泌因子（Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES）等。 TNF-α 和 IL-1β 是典型的促炎因子，而IL-10是一种多功能、多细胞源性的抗炎细胞因子，在抑制炎症反应中发挥关键作用。研究表明，大鼠以60%最大摄氧量强度进行8周有氧运动，可显著降低骨骼肌中TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白含量[1]。离心运动则可引起骨骼肌中IL-1β蛋白含量升高，离心运动引起骨骼肌损伤可能与IL-1β积聚有关[2]。但过度训练如何影响上述因子表达，仍不得而知。RANTES是一种典型的C-C亚族成员趋化性细胞因子，具有强大的诱导白细胞向炎症部位浸润的能力， 还能活化白细胞从而诱导炎症[3]。RANTES表达水平增加与多种炎性疾病相关[4]，其表达水平升高是炎症反应的特征之一[5]。但运动如何影响骨骼肌RANTES表达的研究较少，特别是过度训练如何影响RANTES表达，未见相关报道。

除炎症水平能影响骨骼肌功能状态外，氧化应激水平也是影响骨骼肌功能的重要因素。NADPH氧化酶可介导产生活性氧（ROS），从而加剧组织的氧化应激水平，而gp91phox是NADPH氧化酶的关键催化亚基，因此 gp91phox 常被作为组织氧化状态的指标[6，7]。运动特别是过度训练如何影响骨骼肌gp91phox表达，仍不够清楚。因此，本研究通过建立过度训练模型，对过度训练大鼠腓肠肌炎性因子及氧化应激相关基因表达水平进行了考察，为运动训练特别是加深对过度训练的认识提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

8周龄健康雄性Wistar大鼠26只，购于上海实验动物中心。动物饲养环境温度为（22±2）℃，相对湿度50%～70%，每天光照时间为12 h，自由饮食。将大鼠随机分为安静对照组（C，n=10）、过度训练后36 h取材组（E1，n=8）和过度训练后 7天取材组（E2，n=8）。

1.2 过度训练方案

适应性饲养1周后，过度运动组开始进行递增负荷跑台训练（DSPT-202跑台，中国杭州段氏制作公司），每周6次，周日休息，共训练11周。过度训练方案参考文献方法[8，9]并略作修改（表1）。

1.3 取材

于训练后相应时间点 （C组取材时间同E1组）断头处死大鼠，并分离右后肢腓肠肌，储存于-80℃备用。

1.4 RNA抽提与反转录

在腓肠肌肌腹中点处剪取约60 mg组织，剪碎后加入1 ml Trizol（Invitrogen公司），用超声波细胞粉碎机（JY92-Ⅱ，宁波新芝科器研究所）粉碎，静置10分钟后，加入200 μl氯仿并上下颠倒充分混匀，静置5分钟使明显分层，12000转，4℃离心15分钟，小心吸取500 μl上清入一新离心管，加入等量异丙醇，颠倒混匀并静置10分钟，冷冻离心机（centrifuge 5417R，德国Eppendorf公司）中12000转，4℃离心10分钟，白色沉淀即为RNA，用75%酒精洗涤2次后，加入30 μl DEPC水溶解。测OD值，OD260/280为 1.8～2.0的样品可用，取 2 μg总 RNA，按 Fermentas公司第一链cDNA合成试剂盒说明，用梯度PCR仪（Mastercycler EP，德国 Eppendorf公司）进行反转录，20 μl体系。 合成的 cDNA 储存在-20℃备用[10]。

表1 大鼠过度训练方案

1.5 荧光定量PCR

目的基因引物来自文献[11，12]或由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成，β-actin做内参基因，荧光定量引物见表2。使用定量PCR仪（Rotor-Gene 3000，Corbett Reseach） 进行扩增，SYBR Green试剂盒购自Fermentas公司。所有样本扩增曲线正常，熔解曲线分析显示呈锐而突出的单一产物峰。

1.6 统计学分析

CT 值用经典的 2-△△CT法[13]处理后，用 SPSS17.0 统计软件处理，单因素方差分析和皮尔逊相关分析，结果以平均值±标准差表示，统计学显著性水平定为0.05。

表2 荧光定量PCR引物

2 结果

2.1 腓肠肌炎性因子基因表达

表3 腓肠肌炎症相关基因表达相对C组变化倍数

表3显示，C组、E1组和E2组三组间比较，促炎因子TNF-α和IL-1β mRNA表达量无显著差异（P>0.05）；E1 组抑炎因子白介素 10（IL-10）mRNA表达量相对C组显著降低 （P<0.05），E2组相对C组极显著降低 （P<0.01），E1组和E2组间无差异；E1组和E2组趋化因子RANTES mRNA表达量相对C组显著增加 （P<0.05），E1组和E2组间无差异。IL-10与RANTES呈直线负相关，相关系数r=-0.56（P<0.05）。

2.2 腓肠肌氧化应激基因表达

表4 腓肠肌氧化应激相关基因表达相对C组变化倍数

表4显示，E1组和E2组NADPH氧化酶催化亚基gp91phox mRNA表达量相对C组有增加趋势，但三组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；与C组相比，E1组蛋白激酶C-δ（PKC-δ）mRNA表达量显著增加（P<0.05），E2组 PKC-δ mRNA 表达量相对E1组降低，仍高于C组水平，但无统计学意义。

3 讨论

因炎症水平是影响骨骼肌功能状态的重要因素，因此，本文对过度训练时骨骼肌中炎性因子基因表达水平进行了考察。结果表明:过度训练对大鼠腓肠肌促炎因子TNF-α和IL-1β表达无显著影响，与安静对照组相比，过度训练后36 h组或恢复7天组TNF-α和IL-1β表达均无显著变化；但过度训练显著抑制抑炎因子IL-10表达，与安静对照组相比，运动后36 h组IL-10表达量显著降低，恢复7天后并未恢复正常，而呈进一步下降趋势（P<0.01）。此外，过度训练显著上调趋化因子RANTES表达，运动后36 h组和恢复7天组RANTES表达均显著高于安静对照组，约为安静对照组的2倍。且IL-10与RANTES呈直线负相关，相关系数为-0.56（P<0.05）。上述结果表明，过度训练使抑炎因子IL-10表达降低，使趋化因子RANTES表达显著增加。即过度训练使腓肠肌促炎因子和抑炎因子比例失衡，趋化因子表达增强，从而加剧腓肠肌炎症反应，且停训1周后这种炎症状态并无明显改善。本研究结果与Hamada[14]的研究结果有所不同，他采用75%VO2max强度下坡跑，运动45分钟，停止运动72 h后进行肌肉活检，发现年轻组和老年组肌肉TNF-α表达量均显著增加，而仅老年组肌肉IL-1β表达量显著增加，年轻组无显著变化。推测骨骼肌中炎性因子表达受运动强度、运动形式、运动时间、年龄等多种因素的影响。

除考察炎性因子表达外，本实验还测定了骨骼肌氧化应激相关基因表达。NADPH氧化酶可介导ROS生成，从而在组织氧化应激中发挥作用。NADPH氧化酶由6个亚单位组成:胞膜亚单位（gp91phox、p22phox）和胞质亚单位（p47phox、p40phox、p67phox及Rac蛋白）。静息时上述成分处于解离状态，没有催化活性，受刺激后，p47phox发生磷酸化激活，募集其他胞质成分一起转位到胞膜，与胞膜亚单位结合组装成有活性的NADPH氧化酶，从而发挥催化活性[15，16]。 最新研究表明，p47phox 的磷酸化受PKC-δ调控，PKC-δ是多种组织或细胞中NADPH 氧化酶活性的上游调控分子[7，17-19]。 本研究发现，虽然过度训练对腓肠肌gp91phox表达无显著影响，但调控其活性的信号分子PKC-δ在运动后36 h表达量显著增加，它可使p47phox磷酸化激活，促使各亚基与gp91phox等组装成有活性的NADPH氧化酶，从而介导超氧阴离子及过氧化物的生成，加剧组织氧化应激水平。

4 总结

过度训练对大鼠骨骼肌TNF-α和IL-1β表达无显著影响，但可显著上调RANTES基因表达和下调IL-10基因表达；过度训练可上调骨骼肌氧化应激相关基因表达。

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