δ阿片受体激活对血清饥饿致大鼠成骨细胞凋亡的影响及机制

杨宇，吕刚

（辽宁医学院附属第一医院骨科，辽宁 锦州 1 2 1 0 0 1）

成骨细胞能分泌大量的骨胶原、细胞因子和酶类，促进骨的形成，抑制破骨细胞活性，对骨组织的生长发育、损伤修复以及代谢平衡起着重要作用。因此成骨细胞凋亡进程加速或数量减少可导致骨折和骨质疏松的发生［1，2］。δ 阿片受体激动剂 D-丙（2）-D-亮（5） 脑啡肽（D-Ala2，D-Leu5-enkephalin，DADLE）是阿片中的主要生物碱，已证实其对心脏及成纤维细胞具有保护作用［3，4］。研究发现除中枢和循环系统外，脊髓、肌肉及骨组织［5~7］亦存在大量的阿片受体，目前关于δ阿片类受体激活对成骨细胞的作用研究有限，许多问题还未得到彻底阐明。本实验利用体外培养新生大鼠成骨细胞，研究DADLE对成骨细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

出生24 h以内的SD大鼠，雌雄不拘，辽宁医学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（辽）2003-0007。 DADLE，Naltrindole，GF109203X：Sigma公司；MTT：北京华美公司；AnnexinV-FITC试剂盒：北京宝赛生物技术有限公司；PKC抗体：SANTA CRUZ公司；Caspase-3抗体：Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：无菌条件下，取新生SD大鼠，消毒后断颈处死，剪下颅盖骨，去除结缔组织及血管，PBS冲洗后剪成1 mm3大小的碎块，37℃条件下，0.25%的胰蛋白酶消化15 min，弃去消化液，用0.1%的Ⅱ型胶原酶消化90 min，重复3次，1 000 r/min离心10 min，收集细胞，加入含15%小牛血清DMEM培养基中，以1×106/mL的密度接种于培养瓶中，送入5%二氧化碳孵箱中培养。

1.2.2 试验分组：试验分为对照组（Control）；饥饿组（Model）：成骨细胞无血清培养48 h；DADLE组：饥饿条件下给予 1 μmol·L-1DADLE 培养 48 h；DADLE+NAL组：饥饿条件下给予1 μmol·L-1DADLE和 10 μmol·L-1Naltrindole 培养 48 h；DADLE+GFX组：饥饿条件下给予1μmol·L-1DADLE和10μmol·L-1GF109203X培养48 h。

1.2.3 MTT法测定成骨细胞活力：将细胞密度调至1×105/mL，接种于96孔培养板，各组分别对应加入各干预作用，每孔加入终浓度为5 mg·mL-1的MTT，于CO2孵箱中继续培养4 h后弃去培养液，每孔加入150 μL的DMSO，振荡10 min后，酶标仪检测各孔OD值（570 nm），将测得的吸光值转化为细胞数，求细胞存活率：细胞存活率＝实验组吸光值/对照组吸光值×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测：胰蛋白酶法收集细胞，1 000 r/min离心10 min，PBS洗2次，95%冷乙醇固定，4℃过夜，弃去乙醇，PBS冲洗，调细胞密度为1×106/mL，加入DNAStain综合染液500 μL，避光30 min后流式细胞仪检测。Annexin V-FITC是一种标记有荧光素的钙依赖性磷脂结合蛋白，可特异地与磷脂酰丝氨酸结合，更加灵敏地检测出早期凋亡细胞，调整细胞密度为 1×106/mL，加入 10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，4℃避光染色30 min后流式细胞仪检测。

1.2.5 Western blot分析：收集各组细胞，PBS洗2遍，1 000 r/min离心5 min，弃上清，提取蛋白后Bradford 法定量，各组上样 30 μg，变性的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳，电压积压胶80 V，分离胶120 V，恒压95 V，半干法将蛋白转移至PVDF膜上，室温1 h，4℃封闭过夜，按0.1 mL/cm2膜面积加入1∶1 000稀释的一抗，37℃杂交1 h，TBST漂洗后按0.1 mL/cm2膜面积加入1∶5 000稀释的二抗，37℃杂交1 h，TBST漂洗后显色5 min，放射自显影。

1.3 统计学处理

各组数据以x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析。全部数据采用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理。

2 结果

2.1 DADLE对细胞活力的影响

各组加入DADLE、Naltrindole及GF109203X经无血清培养48 h后，MTT法测定细胞活力。与Control组相比，Model组细胞A570值降低；与Model组相比，DADLE组细胞A570值增高；与DADLE组相比，DADLE+NAL和DADLE+GFX组细胞A570值降低。见图1。

2.2 DADLE对细胞周期的影响

经流式细胞仪分析结果显示，与Control组相比，Model组S+G2+M期百分比降低；与Model组相比，DADLE组S+G2+M期百分比增加，与DADLE组比较，DADLE+NAL和+DADLE+GFX组S+G2+M期百分比均减少。见表1，图2。

表1 各组大鼠成骨细胞凋亡率及细胞周期的比例（x±s，%，n=1 0）T a b.1 A p o p t o s i s r a t i oa n dc e l l c y c l ep r o p o r t i o no f r a t o s t e o b l a s t s（x±s，%，n=1 0）

2.3 DADLE对细胞凋亡的影响

经Annexin V-FITC/PI双染色发现，与Control组相比，Model组凋亡率增加；与Model组相比，DADLE组细胞凋亡率减少；与DADLE组相比，DADLE+NAL和DADLE+GFX细胞凋亡率均增加。见表 1，图 3。

2.4 DADLE影响Caspase-3表达

Western blot分析结果显示，Control组几乎无Caspase-3的表达；经血清饥饿作用于大鼠成骨细胞48 h后出现了Caspase-3的表达，其表达量明显高于 Control组；DADLE组 Caspase-3表达量低于Model组；DADLE+NAL和 DADLE+GFX组的 Caspase-3表达量均明显高于DADLE组，但与Model组比较差异无统计学意义。见图4。

2.5 DADLE影响PKC表达

经无血清饥饿作用48 h后，经Western blot分析，与Control相比，Model组的PKC表达降低；与Model组相比，DADLE组PKC表达增加；与DADLE组相比，DADLE+NAL和DADLE+GFX组的PKC表达降低，但与Model组比较差异无统计学意义。见图5。

3 讨论

正常成人的骨代谢主要依靠成骨细胞和破骨细胞之间的协调平衡，从而使体内的骨转换处于稳定状态，研究表明成骨细胞大量凋亡会引起骨形成不足、骨代谢功能减退或损伤，影响骨构塑与骨重建，导致骨折及骨质疏松的发生［1，2］。因此，阻止或延缓成骨细胞的凋亡，是防治骨折及骨质疏松的一条有效途径［8］。

Kerr等［9］首次提出细胞凋亡，细胞凋亡在正常组织和器官的发育及多种疾病的发生过程中起着重要作用。在体外培养中诱导细胞凋亡的方法很多，血清饥饿是去除培养基中的血清，使细胞在一定时间内处于无血清的状态，这是一种制造缺乏生长因子的刺激环境而诱导的细胞凋亡模型［10］。目前，成骨细胞凋亡是骨代谢平衡失常发生的重要因素之一，亦是导致骨质疏松的主要原因之一。因此，探明其发生发展机制、减少非生理性成骨细胞凋亡，对保护骨结构和功能具有重要的临床意义。

阿片受体在体内分布广泛，已发现除中枢外，脊髓、肌肉及骨组织内亦存在大量阿片受体［5~7］。既往研究结果表明，δ阿片受体参与了减轻细胞凋亡的保护机制［11~13］。最近研究表明PKC活化后可降低血清饥饿所致的心肌细胞凋亡［14］，本研究中DADLE抑制血清饥饿诱导的成骨细胞凋亡作用可被PKC特异性拮抗剂GF109203X阻断，说明PKC的活化与DADLE抑制成骨细胞凋亡作用有关。DADLE可能通过与G蛋白耦联受体结合，激活细胞膜上的磷脂酶C，水解磷脂酰肌醇二磷酸并释放IP3和DAG，升高Ca2+和DAG使PKC磷酸化，作用于底物蛋白从而产生保护作用。Caspase-3目前被认为是凋亡发生过程中所需要的一种重要蛋白酶，同时也是凋亡发生的标志酶［15］，Caspase-3以无活性的蛋白酶原形式存在，在细胞发生凋亡时裂解成17 kDa和12 kDa两个亚单位，它能连续地激活凋亡相关蛋白酶，从而引起细胞凋亡的发生。

本实验研究证明，培养新生大鼠成骨细胞经血清饥饿作用48 h后，可见明显的凋亡现象发生。表现为细胞活力降低，凋亡率增加，S+G2+M期百分比降低及Caspase-3表达增强。给予1 μmol·L-1DADLE后，可明显逆转上述凋亡现象的发生，降低细胞凋亡率，提示DADLE对成骨细胞凋亡具有抑制作用。给予δ阿片受体阻断剂Naltrindole后，DADLE的上述抑制成骨细胞凋亡作用消失。同时，给予PKC特异性拮抗剂GF109203X后，也能阻断DADLE抑制成骨细胞凋亡的作用，说明DADLE抑制成骨细胞凋亡作用是通过激活细胞膜上的δ阿片受体实现的，其作用机制与PKC途径相关。

［1］Jilka RL，Weinstein RS，Parfitt AM，et al.Quantifying osteoblast and osteocyte apoptosis：challenge and rewards［J］.J Bone Miner Res，2007，22（4）：1492-1501.

［2］Bran GM，Stern-Straeter J，H觟rmann K，et al.Apoptosis in bone for tissue engineering［J］.Arch Med Res，2008，39（5）：467-482.

［3］Peart JN，Gross GJ.Morphine-tolerant mice exhibit a profound and persistent cardioprotective phenotype ［J］.Circulation，2004，109（10）：1219-1222.

［4］Shi E，Jiang X，Bai H，et al.Cardio protective effects of morphine on rat heart suffering from ischemia and reperfusion［J］.Chin Med J（Engl），2003，116（7）：1059-1062.

［5］Evans AA，Smith ME.Distribution of opioid peptide receptors in muscles of lean and obese-diabetic mice［J］.Peptides，1996，17（4）：629-634.

［6］Zagon IS，Verderame MF，Zimmer WE，et al.Molecular characterization and distribution of the opioid growth factor receptor （OGFr）in mouse［J］.Brain Res Mol Brain Res，2000，84（1-2）：106-114.

［7］Qinyang W，Lindgren JU，Elhassan AM，et al.Distribution of leucineenkephalin in bone and joint tissues ［J］.Neuropeptides，2002，36（4）：281-286.

［8］Son YO，Kook SH，Choi KC，et al.Quercetin accelerates TNF-alphainduced apoptosis of MC3T3-E1 osteoblastic cells through caspasedependent and JNK-mediated pathways［J］.Eur J Pharmacol，2008，579（1-3）：26-33.

［9］Kerr JF，Wyllie AH，Currie AR，et al.Apoptosis：a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics［J］.Br J Cancer，1972，26（4）：239-257.

［10］Mogi M，Ozeki N，Nakamura H，et al.Dual roles for NF-kappaB activation in osteoblastic cells by serum deprivation：osteoblastic apoptosis and celL-cycle arrest［J］.Bone，2004，35（2）：507-516.

［11］Marzioni M，Invernizzi P，Candelaresi C，et al.Human cholangiocarcinoma development is associated with dysregulation of opioidergic modulation of cholangiocyte growth［J］.Dig Liver Dis，2009，41（7）：523-533.

［12］Yao LL，Wang YG，Cai WJ，et al.Survivin mediates the anti-apoptotic effect of delta-opioid receptor stimulation in cardiomyocytes［J］.J Cell Sci，2007，120（5）：895-907.

［13］Tsao LI，Su TP.Hibernation-induction peptide and cell death：［DAla2，D-Leu5］enkephalin blocks Bax-related apoptotic processes［J］.Eur J Pharmacol，2001，428（1）：149-151.

［14］Wang D，Wang H，Wu G，et al.Protein kinase C mediates the effects of delta-opioid receptor stimulation on survival and apoptosis in neonatal cardiomyocytes cultured in serum-deprived condition［J］.Pharmazie，2009，64（7）：466-471.

［15］Higuchi M，Aggarwal BB，Yeh ET，et al.Activation of CPP32-like protease in tumor necrosis factor-induced apoptosis is dependent on mitochondrial function［J］.J Clin Invest，1997，99（7）：1751-1758.