1株非嗜肺军团菌的鉴定

李曲文，原 灵，陈爱平，杨劲松

(福建省疾病预防控制中心，福建 福州350001)

军团菌病是由军团菌感染引起的一种急性细菌性呼吸道传染病，该病传播途径是经呼吸道，以气溶胶的形式传播。随着城市经济的快速发展，大型建筑物的兴建及随之而来中央空调系统、冷却塔、淋浴设施等现代化设备的广泛使用，人们的暴露机会也会随着增多，军团菌病流行和暴发的危险性也日益增加，目前该病已成为世界各国及我国普遍关注的公共卫生问题[1]。由军团菌引起的疾病有军团菌肺炎、庞蒂亚克热(Pontiac fever)等，大部分由嗜肺军团菌引起，但非嗜肺军团菌也能引起人类疾病[2]。我省2012年7月从一份中央空调冷却塔水中分离出1株疑似非嗜肺军团菌并进行了鉴定分析，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂 GVPC平板、BCYE-α 平板、BCYE-cys平板及血平板购自广州环凯微生物科技有限公司，在有效期内使用。生化反应管购自北京友康有限公司。军团菌乳胶试剂购自英国OXOID公司，嗜肺军团菌诊断血清购自日本生研。PCR反应试剂：Ex Taq 酶、dNTP、10×Buffer、DL 2000 Marker、Wide range DNA Marker(100-6,000)购自 Takara 公司，实验中使用的引物由上海生工合成，琼脂糖、溴化乙锭(10mg/m1)等购自上海生工公司。

1.2 仪器 军团菌培养及鉴定装置包括：TGL-16B台式高速离心机、水平电泳槽、生物安全柜、CO2培养箱、三联抽滤装置 (滤膜 Millipore，0.45μm)。PCR实验仪器包括：英国G-Storm PCR仪，上海培清科技有限公司JS-380A自动凝胶成像分析仪，Bio-rad公司电泳仪和电泳槽，德国Sigma1-14离心机。

1.3 样品处理与分离培养 参照卫生部2006年卫生部 《公共场所集中空调通风系统卫生规范》及《ISO 11731水样军团菌检测》。将采集的300ml水样摇匀后，用孔径为0.45μm的滤膜过滤，将过滤后的滤膜剪碎于5ml水样中震荡洗脱，分别取洗脱液各1ml进行酸处理及热处理，将酸处理及热处理后的水样分别取0.2ml分别涂布于GVPC平板上；另将洗脱液不作处理取0.1ml涂布于GVPC平板上；将上述涂布样品的GVPC平板均置37℃、5%CO2环境中培养3～10d，3d后，每天观察平板菌落生长情况。

1.4 细菌生化鉴定及分型 在每个平板上挑取可疑菌落做革兰染色镜检，形态符合的菌落转种在BCYE-α、BCYE-CYS 和血平板上，置 37℃、5%CO2环境中培养3～5d，进行生长鉴定试验，第2d生长的菌不是军团菌，3d后，凡BCYE-α平板上生长，而BCYE-CYS及血平板上均不生长的可疑菌落接种生化管，同时做触酶试验，生化符合的可疑菌株再进行乳胶凝集试验及军团菌诊断血清进行血清分型。

1.5 PCR鉴定

1.5.1 DNA模板制备 按常规PCR检测方法进行，模板制备(煮沸法)：在生物安全柜中将菌苔(3满环)轻轻刮至1.0ml Eppendorf离心管中，用0.1ml纯水重悬，煮沸 15min后，12000r/min离心 3min，取上清作为PCR扩增反应的DNA模板。

1.5.2 PCR引物 5srRNA引物序列参考文献[3],16SrRNA基因引物系列参照中国疾病预防控制中心传染病预防控制所举办 《军团菌培训班讲课资料》,mip基因引物序列参照文献[4]。引物由上海生工合成。5SrRNA引物序列 F：5’-ACTATAGCGATTTGGAACCA -3’、R: 5’ -GCGATGACCTACTTTCGCAT-3’,片段大小(104bp);16SrRNA 引物序列:F:5’-GAGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’、R:5’-CGGTCAACTTATCGCGTTTGCT，片段大小 (430bp)；mip 引物序列：F:5’-GGTGACTGCGGCTGTTATGG-3’、R:5’ -GGCCAATAGGTCCGCCAACG-3’，片段大小(630bp)。

1.5.3 PCR操作程序 反应总体积50μl，在PCR管中按顺序加入34.0μl纯水，10×Buffer(Mg-Cl22.5mmol/L)5.0μl，dNTP(2.5mmol/l)4.0μl，上下游引物 (20μmol/L) 各 1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.25μl，最后加入模板 5.0μl，双蒸水作试剂空白对照，阳性对照为嗜肺军团菌标准株(LP1)由本科室菌种组保存。反应条件：(1)5SrRNA基因：94℃预变性 5min，94℃30s，48℃30s，72℃60s，共 30 个循环，72℃延伸 3min；(2)16S rRNA 基因：94℃预变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃60s，共30个循环，72℃延伸 3min；(3)mip基因：94℃预变性 5min，94℃30s，48℃30s，72℃60s，共30个循环，72℃ 延 伸3min。取扩增产物5μl上样于1.2%琼脂糖凝胶中，以DL2000Marker(Wide range DNA Marker(100～6,000))为标准分子量,5V/cm的电场强度于0.5×TBE电泳缓冲液中电泳40min后,用凝胶成像仪拍照。

2 结果

2.1 培养基上生长特征 水样在GVPC平板上培养3d长出细小菌落，培养7d长出棕褐色、圆形稍凸、湿润光滑菌落，菌落挑起有黏丝状。

2.2 革兰染色镜检 染色镜检为革兰阴性短杆菌或呈细长头发丝状。

2.2 生长验证试验结果 将可疑菌落转种BCYE-α、BCYE-CYS 和血平板上，置 37℃、5%CO2环境中培养3～5d，结果可疑菌落在BCYE-α平板上生长，而在BCYE-cys及血平板上均不生长。

2.4 生化试验 可疑菌落做触酶试验、氧化酶试验和接种生化管等试验，结果为：触酶阳性、明胶液化试验阳性；氧化酶、马尿酸盐水解、硝酸还原、糖发酵、尿素酶试验均为阴性。

2.5 血清分型 乳胶凝集试验结果显示本菌株与非嗜肺军团菌乳胶凝集，与嗜肺军团菌乳胶不凝集；用军团菌诊断血清进行玻片凝集试验显示和嗜肺军团菌血清 L.gormanii、L.micdadei、L.bozemanii和L.dumoffii不凝集。

2.6 分子生物学鉴定结果 用军团菌属特异性基因5SrRNA和16SrRNA，嗜肺军团菌特异性诊断基因mip进行PCR鉴定，结果如图1。

图1 PCR鉴定结果

结果显示该菌株5SrRNA基因阳性、16SrRNA基因阳性，mip基因阴性。

2.7 结合常规分离培养鉴定 血清学及分子生物学鉴定，结果判定该菌株为军团菌属非嗜肺军团菌种，血清尚未分型。

3 讨论

军团菌病是一种急性细菌性呼吸道传染病，具有病程进展快，病死率高、易爆发流行的特点，其病原体军团菌广泛分布于自然界各种自然水源以及空调水、管道供水系统等人工水源中，而含有军团菌水产生的气溶胶是军团菌病主要传播途径。国内外对军团菌的研究证实军团菌病的流行及传播与集中空调、热水设备等现代生活设施的人工水环境密切相关[5]。由集中空调及供水系统引发的军团菌对水质、空气的污染已成为当今社会关注的一个重要的公共卫生问题。本文检出的非嗜肺军团菌是我省首次在冷却塔水中检出的非嗜肺军团菌，据报道非嗜肺军团菌也能引起人类疾病[2]。

本例为少见的产棕褐色素的军团菌属，一般军团菌在BCYE上菌落生长特点以灰白色菌落多见。5SrRNA基因、16SrRNA基因是军团菌的属特异性基因，mip基因是军团菌的嗜肺军团菌种特异基因。Mahbubani[3]报道应用5SrRNA基因检测军团菌属特异性,可检测到104bp基因片段,该序列较为保守,种间差异较小。16SrRNA是微生物核糖体RNA，在物种进化中保持相对的恒定的结构，具有种属的特异性，因此常作为物种鉴定的基因。鉴于军团菌基因组DNA庞大的数字,其他方法就无法对基因组进行分析,需要使用一些具有代表性的序列,所以选择特异性较高的军团菌种属特异性序列就具有了重要的意义。16SrRNA和5Sr-RNA可用来区分军团菌和非军团菌。mip基因编码巨噬细胞感染增强子蛋白,是一种在多种胞内寄生菌的细菌表面均有表达的外膜蛋白,对嗜肺军团菌进入到阿米巴和巨噬细胞有促进作用,同时破坏了细胞的杀菌功能，mip基因有足够的序列差异来区别嗜肺军团菌与非嗜肺军团菌[6]。5Sr-RNA基因检测军团菌属特异性,可检测到104bp基因片段,该序列较为保守,种间差异较小。对绝大部分军团菌种的16SrRNA序列已被测定,种间差异比较明显,可以鉴定大部分军团菌种,但是其变异程度还不足以区分不同的血清型,目前，已确认的军团菌有50种，70多个血清型，接近20种有临床分离报道。本实验室购买到的非嗜肺军团菌诊断血清只有四种，检出的菌落不与其发生凝聚，结合分离培养鉴定、血清学及分子生物学鉴定结果为军团菌属非嗜肺军团菌种，血清尚未分型。

虽然90%的军团菌爆发是由嗜肺军团菌引起，但是非嗜肺军团菌引起的病例也时有发生。联合5SrRNA基因、16SrRNA基因，mip基因能很好的鉴定军团菌属与非军团菌属，嗜肺与非嗜肺军团菌。PCR方法灵敏度高，除能检测活菌外，还可检测已死亡的菌体DNA，因此若水中存在极微量的军团菌或死菌时，PCR方法能检出，但传统分离方法却是阴性。另PCR引物不但能检测致病性军团菌，也能检测非致病性军团菌，方法的敏感性高和有高度特异性，与传统方法吻合率高，适合作为传统检测方法的补充，提高检测速度和准确度。进行分子生物学鉴定以防漏检，对于防范军团菌病的爆发与流行起了防控作用。

[1]原 灵,陈爱平,詹銮峰,等.福建省2008年公共场所中央空调冷却塔水军团菌污染状况调查 [J].中国人兽共患病学报,2010，26(11)：1080-1081.

[2]何 晖,龚玉娇,马 林,等.一株嗜肺军团菌的分型和定量[J].热带医学杂志,2005,4(02)：195-196.

[3]Mahbubani MH,Bej AK,Miller R,et al.Detection of legionella with polymerase chain reaction and gene probe methods[J].Mol Cell Probes,1990,4(3):175-187.

[4]Jaulhac B,Nowicki M,Bornstein N,et al.Detection of Legionella spp.in bronchoalveolar lavage fluids by DNA amplification[J].J Clin Microbio,l992,30(4):920-924.

[5]冯文如,马 林,刘汉湘.广州市公共场所空调冷却塔水中军团菌污染状况调查[J].华南预防医学,2005,31(3)：60-61.

[6]宣瑞红，胡朝辉，朱庆义.军团菌分子生物学分型测定及其实用性研究进展[J].中国预防医学杂志,2010,11(1):103-105.