旋毛虫感染对小鼠结肠上皮通透性的影响*

李旺林， 曹 杰， 张伟健， 杨 平， 钟俊斌， 杨建荣， 张 通

(广州医学院附属广州市第一人民医院胃肠外科，广东广州510180)

有研究报道，巴西钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)感染导致肠道E－cadherin的表达改变，导致小肠上皮细胞的附着力损失［1］;而多形螺旋线虫(Heligmosomoides polygyrus)感染导致小肠上皮通透性增加［2］。但肠道蠕虫感染及其诱导的Th2反应对结肠上皮通透性影响的相关研究较少见。目前还不清楚蠕虫感染是否可引起结肠上皮通透性改变和如何影响结肠上皮通透性。本文旨在观察旋毛虫对肠道黏膜通透性影响，并初步探讨其机制。

材料和方法

1 动物及分组

选择6到8周大的雌性BALB/c小鼠(SPF级)，以高压蒸汽消毒的食物和水喂养。将BALB/c鼠随机分为2组，即T．spiralis感染组(BALB/c+T．s组)和无T．spiralis感染组(对照组，BALB/c组)。每只小鼠经口服喂养T．spiralis幼虫400条(幼虫配成悬液喂养，并以显微镜鉴定为活虫)。

2 结肠通透性的分析

小鼠感染T．spiralis7 d后，直肠内给予辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP;Sigma)，然后测量血液中HRP浓度判定结肠通透性。在小鼠禁食12 h之后，以2%戊巴比妥钠麻醉(50 mg/kg)，50μL辣根过氧化物酶(含0．6 mg)以针头经直肠注入。辣根过氧化物酶灌注后的0(即为未灌注HRP的时点)、60和120 min后，从尾静脉收集血液样本，采用ELISA法测定血清辣根过氧化物酶浓度。

3 血清IgG1和IgG2a的检测

将上述尾静脉收集的血液样本，以ELISA法检测IgG1和IgG2a的表达量。

4 淋巴细胞细胞因子ELISA检测

T．spiralis感染7 d后，处死小鼠。所有小鼠经断颈法处死。打开腹腔，取出肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node，MLN)。将外周淋巴结分组研磨(溶液为cDMEM)，用70μm的滤器过滤，4℃、1 500 r/min离心8 min，弃除上清，加入2 mL cDMEM溶液，将细胞振荡溶解，将之调成5×109/L。加CD3单克隆抗体孵育，置于CO2培养箱内，5%CO2、37℃静置培养72 h，收集培养液上清，置于－20℃冻存。以ELISA法检测Th2细胞因子白细胞介素4(interleukin－4，IL－4)的表达量。

5 信号转导子与转录激活子6(signal transducer and activator of transcription 6，STAT6)基因敲除小鼠实验

选6～8周雌性基因敲除小鼠(SPF级，BALB/c背景，购于美国杰克森实验室)。将小鼠分为3组，STAT6敲除小鼠组(无 T．spiralis感染，STAT6组)、BALB/c小鼠感染组(BALB/c+T．s组)和STAT6敲除小鼠感染组(STAT6+T．s组)，T．spiralis感染小鼠7 d后，先行尾静脉取血1次(在实验结果中标示为0 min)，然后以HRP经直肠注入，辣根过氧化物酶灌注后60和120 min后，从尾静脉收集血液样本，采用ELISA法测定血清辣根过氧化物酶浓度，以此来判定结肠上皮通透性。处死小鼠，取出肠系膜淋巴结，制作淋巴细胞悬液，加CD3单克隆抗体孵育72 h。收集上清，ELISA法检测细胞因子的变化。

6 统计学处理

数据用均数±标准差(¯x±s)表示，采用Graph-Pad Prism统计学软件处理，进行t检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 T．spiralis感染导致结肠上皮通透性变化

对照组小鼠血清的辣根过氧化物酶量很少。蠕虫感染的小鼠血清辣根过氧化物酶水平显著增高(HRP处理60 min后)。结果表明肠道寄生虫感染后结肠上皮通透性显著增加，见图1。

Figure 1．Serum HRP concentration at different time points in BALB/c mice infected with Trichinella spiralis(T．s)．BALB/c mice were infected with T．s for 7 days．On day 7，horseradish peroxidase(HRP)was infused through rectum，and then serum HRP level was detected．¯x±s．n=5．*P＜0．05 vs BALB/c．图1 不同时点血清HRP浓度

2 血清IgG1和IgG2a的检测结果

与无感染组比较，T．s感染组IgG1表达明显增高，IgG2a表达明显降低，见图2。

Figure 2．Serum IgG1 and IgG2a．BALB/c mice were infected with Trichinella spiralis for 7 days．On day 7，blood was collected by mice tail vein．Serum IgG1 and IgG2a were detected by ELISA．¯x±s．n=5．*P＜0．05 vs BALB/c．图2 各组血清IgG1和IgG2a检测结果

3 肠系膜淋巴结细胞因子ELISA检测结果

加CD3单克隆抗体刺激，无感染组IL－4(21．0±2．3) μg/L，感染组 IL －4(193．0 ±12．5)μg/L，感染组IL－4的表达明显增高，两者比较差异有统计学意义(P ＜0．05)，见图3。

Figure 3．IL－4 production of MLN in BALB/c and BALB/c+T．s mice．BALB/c mice were infected with Trichinella spiralis for 7 days．On day 7，mice were sacrificed．MLN were collected，and then IL －4 production of MLN was detected by ELISA．¯x±s．n=5．*P＜0．05 vs BALB/c．图3 肠系膜淋巴结IL－4的表达

4 STAT6敲除小鼠蠕虫感染不能改变结肠上皮通透性

BALB/c小鼠感染后血清辣根过氧化物酶水平显着增加，有蠕虫感染和无感染的STAT6敲除小鼠血清辣根过氧化物酶量无显著差异，见图4。

Figure 4．Serum HRPconcentration in STAT6 knockout mice experiment．BALB/c and STAT6 knockout mice were infected with T．s for 7 days．On day 7，horseradish peroxidase(HRP)was infused through rectum，and then serum HRP level was detected．¯x±s．n=5．*P＜0．05 vs STAT6+T．s or STAT6．图4 STAT6敲除小鼠结肠组织HRP含量

5 STAT6敲除小鼠肠系膜淋巴结IL－4的变化

加CD3单克隆抗体刺激，BALB/c+T．s组IL－4(193．0 ±12．5)μg/L，STAT6+T．s组 IL －4(15．0±3．1)μg/L，STAT6 组 IL －4(3．0 ±1．2) μg/L，BALB/c+T．s组与 STAT6+T．s组 IL－4表达量比较，BALB/c+T．s组表达明显增高，差异有统计学意义(P ＜0．05)，见图5。

Figure 5．IL － 4 production of MLN in STAT6 knockout mice．BALB/c and STAT6 knockout mice were infected with Trichinella spiralis for 7 days．On day 7，mice were sacrificed．MLN were collected，and then IL－4 production of MLN was detected by ELISA．¯x±s．n=5．*P ＜0．05 vs STAT6+T．s．图5 STAT6敲除小鼠结肠组织中IL－4含量

讨 论

我们的结果表明，在野生型BALB/c小鼠中，小肠T．spiralis感染能够导致结肠上皮通透性增加，但在Th2缺陷的STAT6－/－小鼠中没有出现这种情况。这些结果表明，机制之一可能是旋毛虫感染影响了STAT6信号通路，从而改变结肠上皮屏障功能。

大分子HRP标记探针技术已广泛用于测量肠上皮细胞运输能力［3］。通常情况下，肠腔可溶性抗原通过以下2条路线进行转运:经细胞途径或通过细胞间途径。经细胞的通透性对大分子通过上皮细胞的转运是一个重要的途径，有助于调节免疫激活。有研究显示，肠道蠕虫感染增加了肠道细菌易位和细菌脂多糖吸收加入门静脉循环，从而改变屏障功能［4］，IL－4通过改变细胞间黏附分子明显增强了高分子通透性［5］。

T．spiralis主要寄生在肠道小肠，而我们观察的是结肠上皮屏障功能的影响。因此，结肠上皮屏障功能改变与旋毛虫直接导致的机械性损伤无关。在本研究中，我们用Th2缺陷STAT6敲除小鼠测试小肠蠕虫是否通过蠕虫引起的自适应免疫激活间接影响结肠上皮屏障功能。我们结果表明，在BALB/c鼠中，旋毛虫感染导致了小鼠结肠上皮通透性增加，但是在Th2缺陷STAT6敲除小鼠中，T．spiralis感染却没有出现这种情况，小鼠结肠通透性并没有因T．spiralis感染而增加。这些结果充分表明淋巴细胞活化、尤其是Th2细胞的活化，在肠道蠕虫感染中改变了肠道屏障作用。

Th2细胞因子IL－4和IL－13能够通过STAT6或磷酸肌醇3－激酶(PI3K)途径影响它们靶细胞的激活。此前，Ceponis等［6］使用T84细胞(人类结肠上皮细胞模型)研究IL－4和IL－13参与调节上皮通透性信号转导通路，认为PI3K是IL－4和IL－13调节跨上皮电阻(TER)的主要近端信号途径。但是，最近的研究表明，Th2(IL－13)依赖的屏障调控并不需要PI3K参与，但可能涉及STAT6，IL－13作为STAT6的抑制剂，不能抑制PI3K，但能避免IL－13诱导的 TER损失［7］。我们研究显示，T．spiralis感染在STAT6敲除小鼠中未能改变结肠上皮通透性，这个结果支持了蠕虫感染时STAT6在调节过程中的肠上皮屏障功能的作用。这些结果进一步提示STAT6信号通路和Th2免疫反应在调节肠道黏膜屏障中的作用。

总之，我们的研究表明，蠕虫感染能导致结肠上皮完整性和肠道上皮屏障功能的改变，而在其中一个潜在的机制可能是蠕虫感染诱导的肠道黏膜上淋巴细胞诱导产生的Th2反应参与造成的。以前研究均提示［8－10］，蠕虫感染中肠道黏膜免疫反应的调节涉及多种作用机制，包括先天性和适应性免疫系统效应细胞的调节。对蠕虫免疫调节作用机制更深一步的了解，不仅将为免疫介导的疾病建立新颖和更有效的治疗方法，而且还能为慢性肠道蠕虫感染严重地区的微生物疾病预防和治疗设计有效肠道疫苗。

［1］ Hyoh Y，Nishida M，Tegoshi T，et al．Enhancement of apoptosis with loss of cellular adherence in the villus epithelium 32 of the small intestine after infection with the neamtode Nippostrongylus brasiliensis in rats［J］．Parasitology，1999，119(2):199 －207．

［2］ Shea－ Donohue T，Sullivan C，Finkelman FD，et al．The role of IL－4 in Heligmosomoides polygyrus－induced alterations in murine intestinal epithelial cell function［J］．J Immunol，2001，167(4):2234 －2239．

［3］ Silva MA．Intestinal dendritic cells and epithelial barrier dysfunction in Crohn's disease［J］．Inflamm Bowel Dis，2009，15(3):436 －453．

［4］ Farid AS，Jimi F，Inagaki－Ohara K，et al．Increased intestinal endotoxin absorption during enteric nematode but not protozoal infections through a mast cell－mediated mechanism［J］．Shock，2008，29(6):709 －716

［5］ Kobayashi J，Inai T，Morita K，et al．Reciprocal regulation of permeability through a cultured keratinocyte sheet by IFN －γ and IL －4［J］．Cytokine，2004，28(4 －5):186－189．

［6］ Ceponis PJ，Botelho F，Richards CD，et al．Interleukins 4 and 13 increase intestinal epithelial permeability by a phosphatidylinositol 3－kinase pathway．Lack of evidence for STAT 6 involvement．［J］．J Biol Chem，2000，275(37):29132－29137．

［7］ Weber CR，Raleigh DR，Su L，et al．Epithelial myosin light chain kinase activation induces mucosal interleukin－ 13 expression to alter tight junction ion selectivity［J］．JBiol Chem，2010，285(16):12037 －12046．

［8］ Chen CC，Louie S，McCormick B，et al．Concurrent infection of an intestinal helminth parasite impairs host resistance to enteric Citrobacter rodentium and enhances Citrobacter－ induced colitis in mice［J］．Infect Immun，2005，73(9):5468 －5481．

［9］ Chen CC，Louie S，McCormick BA，et al．Helminthprimed dendritic cells alter the host response to enteric bacterial infection［J］．J Immunol，2006，176(1):472 －483．

［10］ Weng M，Huntley D，Huang IF，et al．Alternatively activated macrophages in intestinal helminth infection:effects on concurrent bacterial colitis［J］．J Immunol，2007，179(7):4721－4731．