麻风患者PBMC中TLR2 mRNA表达与IL-2含量的相关性研究

孙东生， 荣 蓉， 陈雷刚， 张庆波， 龚少智， 罗 丽， 王宝仁， 刘放鸣， 肖德欣， 贾长莎， 张信江

(1.遵义医学院附属医院 皮肤科, 贵州 遵义 563000；2贵阳市金阳医院 皮肤科， 贵州 贵阳 550023；3.贵州毕节地区医院 皮肤科， 贵州 毕节 551500；4. 贵州毕节地区 CDC， 贵州 毕节 551500)

麻风患者PBMC中TLR2 mRNA表达与IL-2含量的相关性研究

孙东生1， 荣 蓉1， 陈雷刚1， 张庆波2， 龚少智1， 罗 丽1， 王宝仁3， 刘放鸣4， 肖德欣1， 贾长莎1， 张信江1

(1.遵义医学院附属医院 皮肤科, 贵州 遵义 563000；2贵阳市金阳医院 皮肤科， 贵州 贵阳 550023；3.贵州毕节地区医院 皮肤科， 贵州 毕节 551500；4. 贵州毕节地区 CDC， 贵州 毕节 551500)

目的检测麻风患者外周血单个核(PBMC)中TLR2m RNA的表达及血清中IL-2的水平,并与正常对照组比较，探讨其在麻风发生和发展中的作用。方法应用SYBR Green荧光定量RT—PCR技术检测TLR2mRNA在麻风现症患者PBMC中的表达以及ELISA技术检测IL-2在血清中的水平。结果麻风患者PBMC中，TLR2 mRNA表达水平0.56±0.06，对照组0.22±0.01；患者组明显高于对照组(P<0.01)。IL-2 (pg/ml)23.42±16.45，对照组6.64±4.24；患者组明显高于对照组(P<0.01)，且其两者呈正相关(P=0.012,r=0.422)。结论麻风患者PBMC中TLR2mRNA的表达水平与血清IL-2水平有一定相关性，TLR2与IL-2可能参与了麻风的发生和发展过程并起到一定的作用。

麻风；Toll样受体2； 白介素-2；外周血单一核细胞

Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是一类重要的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)在天然免疫中通过识别病原相关的分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)而发挥作用，主要包括对外来病原微生物的识别并诱导非特异的前炎症介质的产生。麻风是由(mycobacterium leprae,ML)感染引起的一种慢性传染性皮肤病。TLR2是识别麻风杆菌的主要受体，在对分枝杆菌的免疫反应中起着至关重要的作用[1]。TLR2介导的信号传导产生IL-2等诸多多种细胞因子。我们通过测定麻风患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中TLR2mRNA表达和血清IL-2水平，探讨两者的关系及在麻风免疫中的意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料与分组 随机选择贵州省毕节地区已确诊登记的麻风现症病人116例, 按马德里分类法[2]，结核样型(TT)34例，瘤型(LL)82例；正常对照组为当地无麻风及其他传染病的健康成人50例，年龄、性别与麻风组类似。

1.2 实验方法、试剂及仪器

1.2.1 无菌抽取患者与对照组静脉血4 ml，置枸橼酸钠抗凝管混匀，用Histopaque-1077细胞分离液(美国Sigma公司)分离PBMC。采用RNAiso试剂(大连TaTkRa公司)一步法提取PBMC内总RNA。所提取的总RNA用紫外分光光度计测A260、A280定量并检测其纯度，所有样品比值均为1.8～2.0。取等量总RNA逆转录为第一链cDNA，按试剂盒说明操作，逆转录反应条件：37℃15 min，85 ℃5 s。将cDNA溶液按100，101，102，103，104，105梯度稀释(10倍梯度稀释)后，制作标准曲线，代表各浓度的6个点基本在一条线上。

1.2.2 按RT—PCR扩增反应试剂盒说明操作，TLR2mRNA及β-actin引物序列。用Bio-荧光定量PCR仪检测TLR2mRNA在PBMC中的表达。扩增反应条件：TLR2 PCR：预变性95 ℃10 s，1个循环；变性95 ℃5 s，退火6l ℃20 s，40个循环。β-actinPCR：预变性95 ℃10 s，1个循环；变性95 ℃5 s，退火60 ℃20 s，40个循环。PCR扩增曲线抬头，结合融解曲线分析如出现解链峰则认为有扩增，并进行3%琼脂糖凝胶电泳分析特异性。对有特异扩增的目的基因进行相对定量分析,目的基因的相对表达水平通过2-ΔΔct分析。

1.2.3 采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-2。IL-2 ELISA试剂盒购自上海西唐生物技术有限公司。实验操作参照试剂盒说明书进行，酶标仪(thermo,type1500)。

1.3 统计学方法 本研究数据采用SPSS17.0统计学软件进行统计学处理。采用秩和检验、pearson相关分析。P<0.05 为差异有显著性。

2 结果

2.1 TLR2 mRNA在麻风患者PBMC中表达见表1.TLR2 mRNA在麻风患者PBMC中表达明显高于对照组(P<0.01);麻风组IL-2的表达明显高于对照组(P<0.01)，且其两者呈正相关性(P=0.012,r=0.422)。

组 别例数TLR2mRNAIL-2(pg/ml)麻风组1160.56±0.0623.42±16.45对照组500.22±0.016.64±4.24

2.2 TLR2 mRNA在TT和LL中的表达。

TLR2 mRNA和IL-2在TT组与LL组中的表达未见显著差异P>0.05)。 (见表2)。

组 别例数TLR2mRNAIL-2(pg/ml)LL820.62±0.0722.55±16.35TT340.43±0.1125.53±16.76

3 讨论

TLR2是识别分枝杆菌的主要受体，其介导识别革兰阳性菌细胞壁成分如肽聚糖、磷壁酸以及分支杆菌等[4，5]，TLR2通过识别分枝杆菌胞壁的组分,启动信号传导途径,激活固有免疫细胞,导向抗分枝杆菌适应性免疫[7-12]。我们在研究中发现，TLR2 mRNA在麻风患者PBMC中表达明显高于对照组(P<0.01)。这与罗丽[6]等人的研究结果一致。

TLR2介导的信号传导产生多种细胞因子，包括TNF-α、IL-2、IL-12等。IL-2为Th1细胞分泌的细胞因子，主要介导细胞免疫。其在机体的免疫应答及调节中起着重要的作用，在许多慢性感染性疾病中同样发挥着重要作用。Kang[13]等在研究TLR2时发现带有突变的 TLR2 的麻风患者PBMC分泌IL-2等细胞因子的能力下降。也有研究[14]发现发生1型麻风反应的患者与没有发生1型麻风反应的患者相比其IL-2水平无统计学意义。我们在研究中发现，麻风患者血清中IL-2的水平明显高于对照组(P>0.01)。并且麻风患者PBMC中 TLR2 mRNA和IL-2的表达呈正相关性(P= 0.012,r=0.422)。这提示在麻风杆菌作用下通过TLR2的介导IL-2参与了麻风的发病过程，并在其中发挥了一定的作用。我们的研究同时发现，TLR2 mRNA在TT中的表达低于LL，但无统计学意义(P>0.05)。IL-2在TT中的含量高于LL,但无统计学意义(P>0.05)；TLR2 mRNA在TT中的表达和血清中IL-2的含量无明显相关性,这可能与研究标本量不多有关。

麻风的发病机制十分复杂，通过对TLR2 mRNA和IL-2相关性的分析,有助于我们对麻风发病机制的认识，为麻风的有效预防和控制提供一些理论依据。

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CorrelativestudyonexpressionofTLR2mRNAandserumlevelsofIL-2inperipheralbloodmononuclearcellsofpetientswithLeprosy

Sundongsheng，Rongrong，Chenleigang，Zhangqingbo,Gongshaozhi,Luoli,Wangbaoren，Liufangming，Xiaodexin，Jiachangsha，Zhangxinjiang

(1.Department of Dermatology, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Guizhou.Zunyi 563000,China ; 2. Department of Dermatology, Jinyang Hospital of Guiyang, Guizhou.Guiyang 550023, China; 3. Department of Dermatology, Regional Hospital of Bijie, Guizhou Bijie 551500, China; 4. Centers for Disease Control, Guizhou Bijie 551500, China)

ObjectiveTo research the expression levels of (toll-like recptor，TLR) 2 mRNA and the (interleukin-2，IL-2)in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of the patients with leprosy and the role in the occurrence and development of the leprosy.MethodsSYBR Green fluorescence quantitative RT-PCR was conducted to detect the expressions levels of TLR2mRNA and enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA)was conducted to detect levels of IL-2 in serum.ResultsThe levels of TLR2mRNA in the 116 cases of patients with leprosy were 0.56±0.06, that were 0.22±0.01 in the controls, the level of TLR2 mRNA in the patients with leprosy was significantly higher than the controls (P<0.01)。The levels(pg/ml) of IL-2 of the patients with leprosy were 23.42±16.45, that were 6.64±4.24 in the controls, The levels(pg/ml) of IL-2 of the patients with leprosy was significantly higher than the controls (P<0.01)。Positive correlation were found between levels of IL-2 and the levels of TLR2 mRNA in patients with leprosy(P= 0.012,r = 0.422).ConclusionThe levels of TLR2 mRNA and the levels of IL-2 were high and positive correlation. They may take part in the process of occurrence and development of the leprosy immune。

leprosy; TLR2; IL-2; PBMC

R755

A

1000-2715(2012)01-0034-03

国家自然科学基金(NO:30960350)；贵州省省长资金(NO:2006，48)。

张信江，男，研究方向：感染性皮肤病；E-mail:xinjiangzhang@sohu.com。

[收稿2011-10-09；修回2011-11-21]

(编辑：谭秀荣)