睾酮诱导牛眼小梁细胞组织型谷氨酰胺转移酶的表达

陈 慧 胡义珍 柯晓云 陈晓虹

流行病学研究表明原发性青光眼患者男∶女为1.00∶1.01，其中，原发性闭角型青光眼患者男∶女为1.00∶1.53，而原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)男 ∶ 女 为 2.55∶1.00[1]。这种差异的存在提示POAG发病与性激素可能存在一定的关系。Agapova等[2]发现雄激素可能与青光眼发病有重要联系。眼是性激素作用的靶器官，睾酮在POAG的发病过程中是否起到一定的作用，是本次研究的重点之一。已有研究证明组织型谷氨酰胺转移酶(tissue transglutaminase，tTG)与POAG发病密切相关[3-6]。那么，雄激素的存在，是否可以通过上调tTG在小梁细胞中的表达，从而在POAG的发展过程中起作用，是本次实验的研究重点。

1 材料与方法

1.1 材料 新生牛眼球来自武汉市牛羊加工厂，2 h内用冰瓶运回实验室进行细胞培养。胎牛血清(Hyclone公司)，DMEM+F12培养基(Gibco公司)，鼠抗人Ⅳ型胶原蛋白、鼠抗人纤维连接蛋白、鼠抗人层粘连蛋白(Gibco公司)，鼠抗人tTG(美国Labvision公司)，SP二抗试剂盒(福州迈新公司)，睾酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，Trizol试剂(Sigma公司)，逆转录试剂盒(TOYOBO公司)，引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 牛眼小梁细胞的体外培养及鉴定 在超净台内剪去眼周围的筋膜组织后，将其浸泡于0.2×10－6g·L－1氧氰化汞 +4000 U·mL－1庆大霉素的水溶液中30 min。D-Hanks液冲洗眼球3次后，显微镜下分离取出小梁组织切成1 mm×2 mm的碎块，均匀地贴于培养瓶的瓶底。将培养瓶在37℃、体积分数5%CO2恒温箱内倒置3 h后，待组织块贴壁微干后，加入体积分数20%胎牛血清DMEM培养液适量。将培养瓶放入37℃、体积分数5%CO2恒温箱内进行培养。小梁细胞游离出组织块后，每周换液2次。等细胞长满培养瓶瓶底时，即达到汇合后，用2.5 g·L－1胰蛋白酶消化后按1∶2的比例进行传代培养。制作细胞爬片并行Wright染色及免疫组织化学鉴定。

1.2.2 加入药物诱导 将细胞分为5组。将睾酮用无水乙醇溶解后配成浓缩液，将这5组细胞的培养液吸净并用D-hanks洗2次，加入不含血清的培养液，再分别加入18 ×10－3mmol·L－1、36 ×10－3mmol·L－1、54 ×10－3mmol·L－1、72 ×10－3mmol·L－1的睾酮，放入37℃、体积分数5%CO2恒温箱内培养24 h;正常对照组不加睾酮。

1.2.3 RT-PCR法检测不同浓度睾酮作用后tTG在牛眼小梁细胞的表达情况 取第3代近融合的牛眼小梁细胞(bovine trabecular meshwork cells，BTMC)(每培养瓶大约1×106个细胞)采用Trizol试剂盒(美国MRC公司产品)提取总RNA后。采用TOYOBO公司生产的逆转录试剂盒完成逆转录反应。利用Primer 5.0软件设计牛tTG特异性引物并合成(上海生工生物技术有限公司合成)。tTG引物序列:上游:5’-GTTCCAGTTCGTGCCATCA-3’，下游:5’-CCCTGTCTCCTCCTTCTCG-3’，扩增后片段长度为433 bp。内参扩增引物序列:上游:5’-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’，下游:5’-GACTGCTGTCACCTTCAOCGT-3’，扩增片断长度为212 bp。取cDNA进行PCR扩增，PCR循环参数:94℃变性1 min，52.4℃退火40 s，72℃引物延伸1 min，循环40次。取9 μL RT-PCR产物与1 μL上样缓冲液充分混合后，点样于20 g·L－1琼脂糖凝胶中电泳20～30 min，紫外透射仪上观察并照相。用凝胶图像分析仪摄片，以内参照作为标准，对各泳道进行相对积分值的测定，半定量法比较各实验组tTG mRNA相对含量。

1.2.4 Western blotting测定不同浓度睾酮作用后BTMC中tTG蛋白的表达 收集各组培养细胞，溶于RIPA裂解液中，Ep管冰上操作，反复吹打后，置4℃冰箱10 min，取出于4℃ 12 000 r·min－1离心30 min，吸出上清液，总蛋白浓度的测定采用 Bradford方法测定，BSA作为标准蛋白，设定标准蛋白浓度梯度。取等量蛋白40 μg，经 SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭液封闭，按照说明书比例用封闭液稀释一抗和二抗，在孵育袋中孵育一抗4℃过夜，取出用TBST洗膜3次，每次5 min，再在孵育袋中孵育二抗，37℃ 1.5 h。ECL发光法显色:将ECL化学发光试剂盒中A、B两种液体按照1∶1混合，淋于NC膜上，在暗室内可见蛋白质条带发出绿色荧光，曝光于Kodak底片上，洗片。扫描结果以美国Kodak dslD系统进行半定量分析。

1.3 统计学分析 使用SPSS 13.0统计学软件进行t检验，分析组间表达差异性，α=0.05。

2 结果

2.1 RT-PCR结果 以β-actin为内参照，计算各泳道相对积分光密度值。当睾酮浓度为18×10－3mmol·L－1、36 × 10－3mmol·L－1、54 × 10－3mmol·L－1、72 ×10－3mmol·L－1时，其相对积分光密度值分别为 1.461 ± 0.021、2.111 ± 0.016、2.536 ±0.032、3.176 ±0.026，正常对照组为 1.487 ±0.013(图1)。各组间tTG表达水平存在差异，随着睾酮浓度的增加tTG表达水平也相应增加，BTMC内tTG mRNA水平呈睾酮浓度依赖性。

2.2 Western blotting结果 所测结果显示，在未受睾酮刺激的小梁细胞中，tTG蛋白几乎不表达，或处于一种失活状态，而当睾酮浓度达到72×10－3mmol·L－1时，小梁细胞tTG蛋白的表达明显增加(图2)。

RT-PCR与Western blotting的结果显示，tTG在正常情况下存在于小梁细胞内，但是表达甚少，通过雄激素睾酮刺激后，tTG不仅在基因水平表达增加，而且蛋白水平表达也有增强。

Figure 1 tTG in BTMC showed significant difference in mRNA level treated with different concentrations of testosterone.β-actin was set as control，and the relative integrated value of each line was calculated.N:Normal control group;T1:18 ×10－3mmol·L－1testosterone group;T2:36×10－3mmol·L－1testosterone group;T3:54 ×10－3 mmol·L－1testosterone group;T4:72 ×10 －3mmol·L－1testosterone group.There was no statistical difference between group N and T1，but there were significant differences between group N and group T2，T3，T4(all P＜0.05) 经不同浓度睾酮刺激后的BTMC内tTG mRNA水平表现出明显的差异性，以β-actin为内参，计算各泳道相对积分光密度值。N:正常对照组;T1:睾酮浓度18×10－3mmol·L－1;T2:睾酮浓度 36 ×10－3mmol·L－1;T3:睾酮浓度54 ×10－3mmol·L－1;T4:睾酮浓度72 ×10－3mmol·L－1。N组与T1组间不存在差异性，但N组与T2、T3、T4组比较差异具有统计学意义(均为P＜0.05)

Figure 2 Effects of testosterone with different concentrations on tTG expression in BTMC.N:Normal control group;T1:18 ×10 －3mmol·L－1testosterone group;T2:36 × 10－3mmol·L－1testosterone group;T3:54×10－3mmol·L－1testosterone group;T4:72 ×10－3 mmol·L－1testosterone group.The expression of tTG was changed with the obviously concentration dependant manner 不同浓度睾酮对BTMC内tTG蛋白表达水平的影响。N:正常对照组;T1:睾酮浓度18 ×10－3mmol·L－1;T2:睾酮浓度36 ×10－3mmol·L－1;T3:睾酮浓度 54 ×10－3mmol·L－1;T4:睾酮浓度 72 ×10－3 mmol·L－1。结果显示tTG蛋白表达水平随着睾酮浓度变化而变化，具有明显浓度依赖性

3 讨论

本实验用不同浓度的睾酮刺激BTMC，发现随着雄激素睾酮浓度的增加，BTMC中tTG的表达也随之增加。说明雄激素睾酮对tTG表达的作用有浓度依赖性。

Tovar-Vidales等[6]报道青光眼患者小梁细胞中tTG的表达明显高于正常人群。tTG释放到细胞外基质(ECM)中，并发挥其蛋白交联作用，使ECM蛋白交联并抵抗降解，其作用底物有纤维连结蛋白、层粘连蛋白、Ⅲ型胶原、vitronectin等，因而造成ECM堆积[7]。由于tTG的增加使得ECM发生堆积，最早人们将这些沉积物描述为“斑块样物质”(SD斑)[8]，随着SD斑形成增多，最终导致小梁网和Schlemm管发生狭窄甚至堵塞，使房水外流阻力增加，眼压增高。另外，金属蛋白酶(MMP)是一类锌离子依赖性内源性蛋白水解酶，主要功能是降解ECM和基底膜，而tTG可优先结合MMP-2的激活物，使MMP-2生成下降[9]。MMP的减少使得ECM降解减少，也有可能导致房水外流阻力的增加[10]。郝风芹等[11]用RT-PCR的方法检测BTMC中性激素受体蛋白mRNA的表达，结果显示BTMC有性激素受体表达。根据本实验我们可以推断睾酮可能上调tTG的表达活性，一方面睾酮可能通过激素受体作用，使得tTG合成增加，另一方面睾酮可能与细胞膜表面的雄激素受体结合，开放Ca2+通道，使得细胞内Ca2+浓度增加，更多的Ca2+与tTG结合而使这种酶激活发挥作用。睾酮使tTG合成增加，tTG活化，进而tTG表达上调，通过tTG的作用，从而使得ECM中蛋白交联而不容易发生降解，导致小梁细胞的结构发生改变，使得房水流出阻力增加。当然睾酮的作用机制是多方面的，而 tTG也受很多途径调节，例如 Tovar-Vidales等[12]提出的转化生长因子-β2也调节tTG的表达，所以实验中睾酮与tTG表达上调并不是完全平行的曲线。

1 林明楷，葛 坚，陈慧怡，余克明.青光眼住院病人的构成及变化[J].中国实用眼科杂志，2003，21(12):937-939.

2 Agapova OA，Kaufman PL，Hernandez MR.Androgen receptor and NFkB expression in human normal and glaucomatous optic nerve head astrocytes in vitro and in experimental glaucoma[J].Exp Eye Res，2006，82(6):1053-1059.

3 Ulrich WL，Albrecbt M，Elke LD.Induction of tissue transglutaminase in the trabecular meshwork by TGF-β1 and TGF-β2[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(8):2229-2238.

4 Kojima S，Nara K，Rifkin DB.Requirement for transglutaminase in the activation of latent transforming growth factor-beta in bovine endothelial cells[J].J Cell Biol，1993，121(2):439-448.

5 胡义珍，张海江，熊新春.tTG硫代反义寡核苷酸抑制牛眼小梁细胞tTG的id表ale达s[TJ].眼科新进展，2006，26(3):180-183.

6 Tovar-Vidales T，Roque R，Clark AF，Wordinger RJ.Tissue transglutaminase expression and activity in normal and glaucomatous human trabecular meshwork cells and tissues[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49( 2):622-628.

7 Chen JS，Mehta K.Tissue transglutaminase:an enzyme with a split personality[J].Int J Biochem Cell Biol，1999，31(8):817-836.

8 Kojima S，Nara K，Rifkin DB.Requirement for transglutaminase in the activation of latent transforming growth factor-beta in bovine endothelial cells[J].Cell Biol，1993，121(2):439-448.

9 Belkin AM，Zemskov EA，Hang J，Akimov SS，Sikora S，Strongin AY.Cell-surface-associated tissue transglutaminase is a target of MMP-2 proteolysis[J].Biochemistry，2004，43(37):11760-11769.

10 Wordingep RJ，Clark AF.Effects of glucocorticoids on the trabecular meshwork:towards a better understanding of glaucoma[J].Prog Retin Eye Res，1999，18(5):629-667.

11 郝风芹，姜发纲，张明昌.性激素受体在牛眼小梁细胞中的表达[J].眼视光学杂志，2005，7(2):274-276.

12 Tovar-Vidales T，Clark AF，Wordinger RJ.Transforming growth factor-beta2 utilizes the canonical Smad-signaling pathway to regulate tissue transglutaminase expression in human trabecular meshwork cells[J].Exp Eye Res，2011，93(4):442-451.