罗汉果叶总黄酮对金属离子引起的内皮细胞损伤保护作用及机制研究

王程强 (桂林医学院公共卫生学院，广西 桂林 541001)

胡述立 (武汉亚洲心脏病医院心内科，湖北 武汉 430022)

罗汉果叶总黄酮对金属离子引起的内皮细胞损伤保护作用及机制研究

王程强 (桂林医学院公共卫生学院，广西 桂林 541001)

胡述立 (武汉亚洲心脏病医院心内科，湖北 武汉 430022)

目的：研究罗汉果叶总黄酮对菲咯啉铜致人内皮细胞ECV304 损伤的保护作用及机制，探讨其在动脉粥样硬化防治中的意义。方法：0.2mmol/ml菲咯啉铜诱导人血管内皮细胞损伤，以1mg/ml罗汉果叶总黄酮干预24h，试剂盒测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量以及细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。结果: 罗汉果叶总黄酮对菲咯啉铜诱导的血管内皮细胞诱导的损伤有明显的抑制作用，血管内皮细胞抗氧化酶SOD、GSH-PX的活性增强。结论: 罗汉果叶总黄酮对菲咯啉铜导致內皮细胞损伤具有保护作用，可能与其抗氧化效应有关。

罗汉果叶总黄酮；ECV304；谷光甘肽过氧化物酶；超氧化物歧化酶

环境因素在心血管疾病的发生发展中扮演着重要角色，而血管内皮细胞的受损往往是这一过程中的最早期事件[1]。但内皮功能不全的确切机制还不十分清楚。越来越多的证据显示菲咯啉铜能通过产生羟自由基介导的脂质过氧化作用而损伤内皮细胞[2]。罗汉果作为广西的特色资源，其叶在加工过程中一般被作为废弃物丢弃，既浪费资源又污染环境。近年，陈全斌等采用磷钼络合物法测定了罗汉果叶黄酮的抗氧化能力，发现罗汉果叶黄酮具有一定的抗氧化活性，且对自由基具有很强的清除作用[3-4]。我们以体外培养内皮细胞为研究对象，观察人工提取的罗汉果叶总黄酮对菲咯啉铜诱导的内皮细胞损伤的保护作用及其机制，为罗汉果叶总黄酮在治疗动脉粥样硬化中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

罗汉果叶：采于桂林医学院药学院植物园，50℃烘箱烘干，粉碎后备用。ECV304细胞购自中国科学院上海细胞库。RPMI-1640 培养基购自Hyclone公司，小牛血清购自Gibco公司。乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-PX) 检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。RE-52AA旋转蒸发仪，D-300.3多功能电子天平，SHB-IIIA 真空泵，DJ灵巧型粉碎机。

1.2方法

1.2.1 细胞培养 ECV304细胞株用含10%小牛血清RPMI1640培养液(含100mg/L青霉素和链霉素)培养并置于37 ℃，5% CO2饱和湿度的培养箱内备用。

1.2.2 罗汉果叶总黄酮的制备与测定 参照梁英等[4]对罗汉果叶总黄酮的改良提取方法：固液比1∶30，煮沸提取3次，每次提取50min。以芦丁为对照物，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色体系吸光光度法测定总黄酮的含量。

1.2.3 实验分组 测定其它指标的细胞，无血清培养基同步化12h，随机分为3组：①空白对照组(ECV304)：不加任何刺激因素；②菲咯啉铜组(ECV304+(Phen)2Cu2+)：加入终浓度为0.2mmol/ml的菲咯啉铜；③罗汉果叶总黄酮保护组(ECV304+(Phen)2Cu2++FLSG)：加入终浓度为0.2mmol/ml的菲咯啉铜和1mg/ml的罗汉果叶黄酮。各组细胞加入处理因素后继续培养24h，收集细胞培养液，测定LDH、MDA含量；收集细胞检测SOD、GSH-PX活性。

1.2.4 测定LDH、MDA 含量以及SOD、GSH-PX活性 收集12 孔培养板中培养液，按照试剂盒说明书测定LDH和MDA含量；培养板中细胞用PBS洗2次，刮取细胞，加入冰冷PBS悬浮细胞，超声15s，反复冻融3次，离心，按照试剂盒方法测定SOD、GSH-PX活性。

1.3统计学分析

2 结 果

2.1罗汉果叶总黄酮的提取

按照改良方法提取的总黄酮得率为2.54%，与梁英等所做效率相近，用生理盐水稀释成所需浓度备用。

2.2罗汉果叶总黄酮对菲咯啉铜诱导内皮细胞损伤的保护作用

细胞培养液中LDH检测表明：经(Phen)2Cu2+刺激24h后细胞分泌的LDH含量(419.27±16.73 )U/L，明显高于未加任何处理因素的空白组(122.42±6.67 )U/L。而经过终浓度为1mg/ml的罗汉果叶总黄酮处理的药物保护组细胞分泌的LDH含量为(63.56±8.02 )U/L，明显低于(Phen)2Cu2+组，两者差异有统计学意义(Plt;0.01)。FLSG组较(Phen)2Cu2+组MDA含量明显降低，两者差异有统计学意义(Plt;0.05)，其中(Phen)2Cu2+组MDA为(1.298±0.091)μmol/L，而FLSG组MDA为(0.551±0.082)μmol/L；同时FLSG保护组的SOD、GSH-PX活性明显高于(Phen)2Cu2+组，(Phen)2Cu2+组SOD为(21.95±2.47)mU/L，GSH-PX为(683.31±3.76)kU/L；FLSG保护组SOD为(32.17±2.56)mU/L，GSH-PX为1195.90±4.19)kU/L，两组差异均有统计学意义(Plt;0.05)。

3 讨 论

环境因素在心血管疾病的发生发展中扮演着重要角色，而血管内皮细胞的受损往往是这一过程中的最早期事件。菲咯啉铜能通过产生自由基·OH介导的脂质过氧化作用而损伤内皮细胞。罗汉果叶黄酮具有一定的抗氧化活性，且对自由基具有很强的清除作用。我们通过改良方法提取罗汉果叶总黄酮，提取效率很高。LDH 和MDA是一种细胞内的酶，广泛存在于细胞浆内，当细胞破坏或细胞膜通透性增加时，其水平均明显增高，可反映细胞或细胞膜损伤的程度[5-6]。菲咯啉铜作用于内皮细胞24h后促进细胞膜脂质过氧化和胞膜损伤，菲咯啉铜组LDH、MDA含量明显升高，而罗汉果叶黄酮可使菲咯啉铜损伤细胞的LDH、MDA含量明显降低，说明罗汉果叶黄酮通过清除氧自由基，达到修复受损的细胞膜和保护其完整性的作用。

高脂蛋白环境可使机体产生大量自由基，生物膜上的不饱和脂肪酸受活性氧作用，产生大量脂质过氧化物，使生物膜结构和功能改变，从而造成组织细胞的损伤。在保护细胞免受或减轻活性氧损伤的过程中，细胞内SOD和GSH-PX等具有抗氧化功能的酶起着不可忽视的作用[7-8]。SOD催化超氧根阴离子生成H2O2和O2，GSH-PX可将H2O2和过氧化物还原为H2O或相应无毒的醇。本结果证实,菲咯啉铜组细胞内SOD和GSH活性较空白对照组降低，罗汉果叶黄酮保护组细胞内SOD和GSH-PX活性比菲咯啉铜组显著提高，可见罗汉果叶总黄酮具有保护细胞内SOD和GSH-PX活性的作用，从而增强ECV304细胞自身抗氧化能力。综上所述，罗汉果叶总黄酮可能是通过保护ECV304细胞内SOD和GSH-PX活性从而保护内皮细胞免于菲咯啉铜造成的损伤。罗汉果叶总黄酮作为抗氧化的中药在动脉粥样硬化的临床治疗上有着广阔的前景。

[1]杨菊贤，杜勤.环境污染是促发心血管疾病的重要危险因素[J].心血管病学进展，2008，29(2)：214-216.

[2]彭少君，邹国林.菲咯啉铜与脂质体过氧化损伤[J].江西医学院学报，2003，43(2) ：26-29.

[3]陈全斌，苏小建，沈钟苏.罗汉果叶黄酮抗氧化能力研究[J].食品研究与开发，2006 ，27(10)：189-191.

[4]梁英，朱志仁，潘英明，等.罗汉果叶总黄酮的提取及清除自由基活性研究[J].食品科技，2010，35(11) ：211-218.

[5]赵林钢，徐振军，张良.姜黄素对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞损伤的[J].江苏中医药，2009，41(11) ：75-76.

[6]彭小春，马红莺，尹刚，等.川芎嗪抗动脉粥样硬化机制的研究[J].时针国医国药，2010，21 (5) ：1130-1131.

[7]魏芸，彭小春.川芎嗪对血管内皮细胞损伤的保护作用[J].长江大学学报：自科版医学卷，2010，4(3) ：223-224.

[8]邓暑芳，李素云，贺性鹏.甲基叔丁基醚对胎鼠脑组织MDA、SOD及GSH的影响[J].南华大学学报：医学版，2007，35 (1) ：7-9.

[编辑]一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.03.001

R589.2；R329.3

A

1673-1409(2012)03-R001-02

2012-01-03

2010年广西自治区教育厅科研课题(201010lx358)

王程强(1981-)，男，湖北武汉人，讲师，硕士，主要从事公共卫生的教学与研究工作。