基于ITS2条形码的五加皮基原植物及其易混品的鉴定△

曾旭，李秋实，王钤，谢丽芳，张亚兰，罗焜，刘志华，3*

（1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.中国药科大学，江苏 南京 210089；3.南京林业大学，江苏 南京 210037；4.中国医学科学院信息中心，北京 100730；5.北京城市学院生物医药学部，北京 100083）

基于ITS2条形码的五加皮基原植物及其易混品的鉴定△

曾旭1，2，李秋实1，王钤1，谢丽芳4，张亚兰5，罗焜1，刘志华1，3*

（1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.中国药科大学，江苏 南京 210089；3.南京林业大学，江苏 南京 210037；4.中国医学科学院信息中心，北京 100730；5.北京城市学院生物医药学部，北京 100083）

目的：对五加皮基原植物及其易混品进行分子鉴别，为临床用药提供科学依据。方法：从GenBank数据库下载五加皮基原植物及其易混品的ITS2序列，经CodonCode Aligner，MEGA4.0等软件进行序列拼接和分析，构建NJ（邻接）、ME（最小进化）树，并应用Koetschan等建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构辅助分析。结果：基于ITS2序列的两种系统聚类树都易于将五加皮基原植物细柱五加与其易混品鉴别开；比较与细柱五加亲缘关系较近的同属易混品二级结构可以看出，细柱五加在螺旋区茎环的数目、大小、位置以及螺旋臂由中心环伸出时的转角等方面，与其易混品间具有较明显区别。结论：ITS2序列可以将五加皮基原植物及其易混品区分开，在药用植物基原鉴定方面具有重要应用价值。

五加皮；DNA条形码；ITS2；分子鉴定

五加皮为五加科五加属植物细柱五加Acanthopanax gracilistylusW.W.Smith的干燥根皮［1］，具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心等功能［2］。五加皮用药历史悠久，地方习用品种较多，混用现象较为严重。易混品主要有五加科植物糙叶五加A.henryi、红毛五加A.giraldii，萝藦科植物杠柳Periploca sepium［3］。此外还有五加科植物刚毛五加A.simonii、白簕花A.trifoliatus、无梗五加A.sessiliflorus、刺五加A.seticosus、多蕊木Tupidanthus calyptratus，茄科植物枸杞Lycium chinense、宁夏枸杞L.barbarum，茜草科植物牛白藤Hedyotis hedyotidea等［4-14］。由于正品与易混品之间单靠传统鉴别方法鉴定存在较大难度，所以本研究采用DNA条形码技术，以目前倍受关注的ITS2序列片段为条形码［15-23］标准，对五加皮基原植物及其多种易混品进行DNA条形码鉴别研究，建立该药材的分子鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

所用ITS2序列均从GenBank数据库下载，详见表1。

表1 五加皮基原植物及其易混品样本来源表

1.2 数据分析

样本数据使用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法进行分析，去除两端5.8S和26S区段获得ITS2间隔区序列。对包括五加皮基原植物与其易混品的17条ITS2序列使用CLUSTALX软件进行序列比对分析，并用MEGA 4.0软件对结果进行种内、种间遗传距离的计算。计算基于Kimura 2-Parameter（K2P）双参数模型，用 NJ邻接法（Neighbour-2-Joining Method，NJ）和最小进化法（Minimum Evolution，ME）将比对过的序列构建成系统发育树（1000次重复bootstrap检验各分支的支持率）以直观鉴定各物种［24］。最后，使用德国Koetschan等［25］建立的 ITS2网站 http：//its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/cgi-bin/index.pl预测 ITS2二级结构。

2 结果与分析

2.1 序列比较

五加皮基原植物细柱五加的ITS2序列长度为230 bp，具有一个Poly C结构和一个Poly A结构，GC含量分别为62.2%，五加皮基原植物与其主要易混品ITS2序列间存在较多的变异位点，根据Kimura 2-parameter（K2P）参数遗传距离模型计算得到的序列间遗传距离，种间平均K2P距离为0.371。与细柱五加遗传距离最远的为杠柳，距离值为0.675，距离最近的为刚毛五加，距离值为0.028。

2.2 聚类分析

基于ITS2序列，通过邻接法（NJ）所构建的系统聚类树图（图1）可以看出，五加科植物和其中的五加属（Acanthopanax）植物分别都聚集为一枝，支持率为100%和93%，而细柱五加的不同样本数据聚在一枝，支持率为93%，并且枝长较短，表现出单系性。与其他同属植物，包括红毛五加，无梗五加，刺五加，刚毛五加，白簕花，以及与其同科植物多蕊木，都能由分枝的枝长和支持率的不同，明显区分而鉴别开来。此外，杠柳的3个样本数据相聚为一枝，与细柱五加差别非常明显。枸杞和宁夏枸杞聚集为一枝，牛白藤独自为一枝，与细柱五加区别明显。

基于ITS2序列构建的五加皮基原植物及其易混品的最小进化树（ME）（图2）与邻接法（NJ）所构建的系统聚类树对比可以反映出，细柱五加的4个样本都聚集为一枝，枝长较短，都支持了单系性的特点。对比结果还反映出，利用ITS2序列来鉴别五加皮基原植物与其易混品，无论与正品亲缘关系远近，都有很好的鉴别效果。

图1 基于ITS2序列构建的五加皮基原植物及其易混品的邻接（NJ）树

图2 基于ITS2序列构建的五加皮基原植物及其易混品的最小进化树（ME）

2.3 五加皮基原植物及其主要易混品ITS2序列二级结构

从五加皮基原植物与其主要易混品ITS2二级结构比较可以看出，主要差异位于螺旋（Helix）Ⅰ区和Ⅲ区，表现在茎环（Loop）的数目、大小、位置以及螺旋臂由中心环伸出时的转角，不同物种间有或多或少的区别。如图3所示，细柱五加二级结构螺旋Ⅰ顶部存在2个小茎环 （Loop）相距较远，而刺五加和杠柳2个物种二级结构螺旋Ⅰ顶部的茎环在大小及位置上均与细柱五加存在明显区别。细柱五加二级结构螺旋Ⅲ的茎环在数量、大小及位置与其他物种也存在明显不同。此外，细柱五加二级结构螺旋Ⅱ顶部的茎环在数量、大小及位置与无梗五加区别较大，因此，ITS2二级结构也可作为辅助鉴别手段。

图3 五加皮及其易混品的ITS2二级结构比较

3 讨论

ITS2作为DNA条形码序列，可以有效地将五加皮基原植物与其易混品区分开。ITS2二级结构用于亲缘关系较近的同属易混品的鉴定，可以直观地区分五加属的多种植物，鉴别五加皮的易混品种［26-29］。同时，由邻接（NJ）法构建的系统聚类树和最小进化树（ME）皆可以看出，细柱五加的4种不同样本都单独聚集为一枝，支持率分别达到93%和78%，并且枝长较短，体现出较强的单系性，说明了细柱五加与其他易混品种极易区分。此外，在两种聚类图中，五加属植物聚集为一枝（支持率＞93%）；五加科植物聚为一枝（支持率皆为100%）。以上证据说明不同属、不同科的植物，利用ITS2作DNA条形码序列，能够非常准确地区分开来。有文献报道，五加属植物、多蕊木属植物亲缘关系较近，亦有人曾提出 “五加属可能起源于多蕊木属”的论点［30］，从本研究结果也可以看出五加属植物与多蕊木属植物具有密切的亲缘关系。综上所述，ITS2作为DNA条形码序列不仅能区别五加皮基原植物与其易混品，同时，对于探讨五加属的分类学关系亦能起到重要的参考价值。

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Molecular Identification of Acanthopanacis Cortex Original Plant and Its Adulterants Based on ITS2 DNA Barcode

ZENG Xu1，2，LIQiu-shi1，WANG Qian1，XIE Li-fang4，ZHANG Ya-lan5，LUO Kun1，LIU Zhi-hua1，3
（1.Institute of Medicinal Plants Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing100193China；2.China Pharmaceutical University，Nanjing210098China；3.Nanjing Forestry University，Nanjing210037China；4.Information Center，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100032China；5.Development of Pharmaceutical Sciences，Beijing City University，Beijing100083China）

Objective：To discriminate Acanthopanacis cortex original plant and its adulterants，and assure the authenticity and clinical curative effect of thismedicalmaterial.Methods：Download the ITS2 barcode sequences ofAcanthopanax gracilistylusand its adulterants from GenBank database.Sequence assembly and consensus sequence generation were performed using the CodonCode Aligner.Sequence analyseswere carried outby MEGA4.Phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining and Kimura 2-parameter methods.The ITS2 secondary structure was predicted using the ITS2 database and website found by Schultz et al.Results：In the two cluster dendrograms，Acanthopanax gracilistylusand its adulterantswere observed in a significant difference.To compare the ITS2 secondary structure of the origin plants of Acanthopanacis Cortex and its adulterants，we noticed that there were obviously distinguishes from other species in the number，size，position of loop and the angle of helix exsertion.Conclusion：ITS2 can be used to correctly identifyAcanthopanax gracilistylusand its adulterants，and it has a broad application prospect in the identification of Traditional Chinese Medicine.

Acanthopanax gracilistylus；DNA barcoding；ITS2；Identification

2011-11-23）

国家自然科学基金（81102746，81100077），北京市自然科学基金（5113033），国家人事部留学回国人员科技活动择优资助项目，美国中华医学会基金（A2009001），国家科技重大专项（2012ZX09301-002-001-025），协和青年基金，协和新星

* ［通讯作者］刘志华，Tel：（010）57833112，E-mail：zhliu＠implad.ac.cn