附子中脂类生物碱的电喷雾三重四极杆质谱研究

葛京城，许庆轩，闫 静,陈 键，何滟滪

(1. 黑龙江中医药大学研究生学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江大学农作物研究院，黑龙江 哈尔滨 150081)

2011-07-15；

2011-11-12

葛京城(1984～)，男(汉)，黑龙江双鸭山人，硕士研究生，药物分析专业。E-mail:hljflt@126.com

闫 静(1962～)，女(汉)，黑龙江哈尔滨人，教授，从事药物质谱研究。E-mail:yanjing_002@163.com

附子中脂类生物碱的电喷雾三重四极杆质谱研究

葛京城1，许庆轩2，闫 静1,陈 键1，何滟滪1

(1. 黑龙江中医药大学研究生学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江大学农作物研究院，黑龙江 哈尔滨 150081)

附子是常用的中药药物，其中含有的脂类生物碱是附子中重要的活性成分。为了对附子中脂类生物碱的复杂体系进行快速分析，以附子中脂类生物碱为研究对象，建立一种稳定、高效、可靠的分析方法，本研究利用电喷雾三重四极杆质谱的多种扫描功能(全扫描、子离子扫描、母离子扫描、中性丢失扫描)分析附子中脂类生物碱。脂类生物碱间的差别分两种，其一是由于生物碱骨架不同导致的差别；其二是由于C8位所连接的脂肪酸的不同导致的差别。根据这两种差别，分析出附子中含量最多的4类生物碱骨架以及3类C8位取代脂肪酸，共12种脂类生物碱。三重四极杆质谱的母离子扫描及中性碎片丢失扫描功能用于分析附子中脂类生物碱，扫描速度快、效率高、一次扫描同时确定多种结构，所得结果稳定、可靠。

附子；脂类生物碱；电喷雾质谱；母离子扫描；中性丢失

制附子为毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaeliDebx)子根的炮制品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛等功效，用于亡阳虚脱、肢冷脉微、心阳不足等症的治疗[1]。制附子中含有3种类型的生物碱，包括双酯型生物碱、单酯型生物碱以及脂类生物碱，其中双酯型生物碱毒性最大。附子经过炮制，双酯型生物碱转化为毒性较小的单酯型生物碱，脂类生物碱的毒性介于双酯型生物碱和单酯型生物碱之间[2-3]。Kitaagawa等[4]首先在川乌中发现了一类双酯型生物碱的C8位乙酰基被亚油酸等长链脂肪酰基取代所形成的衍生物，命名为脂类生物碱(lipo-alkaloids)。王勇等[5]利用电喷雾质谱技术分析附子及其复方四逆汤中脂类生物碱的变化，证明了附子在复方配伍的过程中，脂类生物碱发生酯交换反应。越皓等[6-7]发现附子与甘草共煎后，脂类生物碱含量显著增长。Kawata等[8]发现双酯型生物碱在肠内菌的作用下能够转变成脂类生物碱，提示脂类生物碱可能在体内发挥药理作用。因此可以推断，脂类生物碱是附子中重要的活性成分，并在附子复方配伍中发挥着重要的作用，对其进行研究有助于揭示附子的炮制和配伍原理，揭示附子药理作用与化学成分之间的关系。由于附子中脂类生物碱种类繁多，且结构相似，因此液相色谱等常规方法难以对其进行有效的分析。本研究应用电喷雾三重四极杆质谱的多种扫描功能(全扫描、子离子扫描、母离子扫描、中性丢失)对附子中脂类生物碱进行分析。

附子中主要含有的3种类型C19二萜类生物碱，其结构示于图1和表1[9-12]。附子中的双酯型生物碱主要为次乌头碱(hypaconitine,HA,[M+H]+=616)、去氧乌头碱(deoxyaconitine,DA,[M+H]+=630)、中乌头碱(mesaconitine,MA,[M+H]+=632)、乌头碱(aconitine,AC,[M+H]=646)等。由于这些双酯型的结构极其相似，差别仅在于N原子联接CH3或C2H5以及C3和C10位置是H或OH，因此其串联质谱也有着相似的裂解规律。以上4种双酯型生物碱的最强子离子分别为m/z556、570、572、586，都是由C8位失去一分子乙酸所得。单酯型生物碱为双酯型生物碱C8位乙酰基水解失去乙酸所得。脂类生物碱(lipo-alkaloids)由双酯型生物碱的C8位乙酰基被油酸、亚油酸、亚麻酸或棕榈酸等长链脂肪酸取代后形成的。脂碱在质谱子离子扫描中，C8位最容易断裂，失去脂肪酸，所得子离子与双酯型生物碱二级谱子离子相似，即它们含有相同的生物碱骨架结构。

图1 乌头类生物碱结构式Fig.1 Constitutional formula of aconitum alkaloids

如果C8位取代基(图1中OR4)转变为OH就是单酯型生物碱，当C8连接的是长链脂肪酸酯即为脂类生物碱。

1 试验部分

1.1主要仪器与装置

Waters UPLC-Quattro Premier三重四极杆质谱：美国Waters公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)及masslyns4.1数据处理系统。

表1 附子中部分已知的乌头类生物碱

1.2主要材料与试剂

制附子为黑顺片：购于哈药集团人民同泰药店，黑龙江中医药大学药学院生药教研室鉴定为毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaeliDebx)子根的炮制品,使用前磨成粉末；甲醇(色谱纯)：美国Fisher公司产品；乙醇、盐酸、氯仿(分析纯)：天津科密欧化学试剂有限公司产品。

1.3试验条件

毛细管电压：3.5 kV；锥孔电压：55 V；萃取电压：3 V；正离子电喷雾电离模式；源温度：100 ℃；脱溶剂气温度：200℃；碰撞能量：55 V；注射泵流速：10 μL/min。

1.4样品的制备

取500 g黑顺片浸于95%乙醇中，超声提取1 h，过滤得提取液，滤渣按上述方法处理两次，合并提取液，蒸出乙醇，得到乙醇浸膏，加入200 mL 0.4%盐酸水溶液，搅拌1 min，静止1 h，抽滤得沉淀，将沉淀用100 mL 0.4%盐酸水溶液清洗2次，溶于氯仿，用等量0.04%盐酸水溶液萃取4次，蒸出氯仿，即得到脂类生物总碱。取0.01 g脂类生物总碱药膏，溶于100 mL甲醇中，过0.45 μm滤膜，供电喷雾质谱分析。

2 结果与讨论

2.1脂类生物碱的子离子扫描研究

脂类生物碱全扫描图示于图2。m/z828、812、826、852、838、868等为脂类生物碱中含量较高的成分。选取丰度最高的m/z828为例进行分析。

图2 脂类生物碱的电喷雾质谱全扫描图Fig.2 ESI-MS/MS full scan chart of lipo-alkaloids

对m/z828离子进行子离子扫描，示于图3，得到的碎片离子为m/z572、540、512。m/z572离子是母离子的C8位失去一分子棕榈酸所得；m/z540为母离子失去棕榈酸和甲醇所得；m/z512为母离子失去棕榈酸和甲醇以及CO所得，其裂解规律与中乌头碱标准品(mesaconitine,MA,[M+H]+=632)相似,根据参照文献[13]可以确定m/z828的物质为8-棕榈酰-苯甲酰中乌头原碱。

2.2脂类生物碱的多种扫描方式研究

由于附子中脂类生物碱有上百种之多，单纯地使用质谱子离子扫描功能确定其结构工作量较大，因此本研究采用了多种扫描方式相结合的方法确定其结构。许多脂类生物碱都有相同的生物碱骨架，它们在串联质谱图上具有相同的子离子，因此采用母离子扫描的方式确定其结构更为方便。例如，对子离子m/z572进行母离子扫描，示于图4。这样在全扫描图中的脂类生物碱中能产生m/z572子离子的母离子都可以扫描出来，m/z828、852、854等都是拥有相同子离子m/z572的脂类生物碱。对图4进行放大，可以看到更多的脂类生物碱信息，示于图5。m/z868、884、870、866、882、886等都是拥有相同子离子m/z572(生物碱骨架)的脂类生物碱。用扫描得到质荷比数减去子离子质量572得到的即是C8位取代的长链脂肪酸质量数。

图3 m/z 828子离子扫描图Fig.3 ESI-MS/MS daughter scan mass spectrum of the ion at m/z 828

图4 m/z 572母离子扫描图 Fig.4 ESI-MS/MS parent scan chart of the ion at m/z 572

同样由于许多脂类生物碱都含有相同的C8位取代基，所以在二级谱中会失去相同的中性碎片(C8位取代基)，因此采用中性丢失的扫描方式也可以快速获得具有相同脂肪酸酯结构的生物碱。中性丢失256 u的质谱图示于图6，m/z828、812、826、842、810离子都含有棕榈酸酯。以上质荷比数减去256(棕榈酸)所得即是其对应的生物碱骨架。

图5 m/z 572母离子扫描图局部放大图 Fig.5 Partial enlargement chart of parent scan at the ion m/z 572

图6 中性丢失256 u扫描图 Fig.6 The scan chart of neutral loss 256 u

例如，由于m/z828离子在子离子扫描中失去256 u(棕榈酸)得到m/z572的子离子(生物碱骨架)，采用中性的碎片丢失和母离子扫描相结合的方法，分别对m/z572离子进行母离子扫描，对m/z256(棕榈酸)进行中性丢失扫描，从而以m/z828为中心，在横向(生物骨架)和纵向(C8位取代基)上扩展开，可以得到许多同8-棕榈酰-苯甲酰中乌头原碱具有相同生物骨架或者相同C8位取代基的脂类生物碱。同样可以采用两种扫描方式相结合的方法对m/z812、826、852、838、868等脂类生物碱进行分析，均能得到大量的信息，从而可以确定多种脂类生物碱。表2中列举了采用上述方法所得的附子中12种脂类生物碱，它们是由4类不同的生物碱骨架分别与3类不同的C8位取代脂肪酸相结合组成。

表2 附子中常见的几类生物碱骨架与C8位取代脂肪酸以及由其所组成的脂类生物碱

样品制备方法参照文献[14]，根据脂类生物碱具有长酯链、极性小、难溶于水、溶于乙醇的特点进行提取。通过乙醇超声提取，双酯型生物碱与脂类生物碱被共同提取出来，根据双酯型生物碱溶于酸水，而脂类生物碱难溶于酸水的性质，采用酸水处理、所得沉淀物溶于氯仿后酸水萃取的方法纯化，此方法可以有效地将双酯型生物碱与脂类生物碱分离开，得到较纯净的脂类生物总碱。

在试验中发现的生物碱骨架和C8位取代脂肪酸有很多，表2中不能全部展现出来，只列举出附子中含量相对多的、具有代表性的几类生物碱骨架和C8位取代脂肪酸。另外，在研究中发现某些脂类生物碱具有相同的准分子离子峰，如表2中，8-亚油酰-苯甲酰中乌头原碱与8-油酰-苯甲酰脱氧乌头原碱的准分子离子峰都为852，但其生物碱骨架与C8为取代基均不相同，虽然准分子离子峰都为852，但是却包含了两种不同的脂类生物碱，采用本研究中的方法可以有效的将其区分开来，独立进行分析研究，所得结果精准、可靠。

3 结论

由于脂类生物碱结构相近，性质相同，数量庞大，脂类生物碱目前尚不能完全分离，只能合成得到，且合成条件苛刻，标准品十分难得，使用质谱方法确定其结构是目前最有效的方式；其次，串联质谱用于脂类生物碱的结构确证已经有很多文献报道[13，15-17]，并且普遍得到认可。三重四极杆质谱不同于离子阱质谱，前者是空间上的串联，后者是时间上的串联，由于三重四极杆质谱特殊的串联方式，使其具有离子阱质谱不具备的一些功能，如母离子扫描，中性碎片丢失扫描等，而人们往往只重视了三重四极杆质谱多反应监测(MRM)功能，忽略了其他功能，本研究采用母离子扫描及中性碎片丢失扫描功能分析了附子中脂类生物碱，得到了良好的效果。扫描速度快、效率高、一次扫描同时确定多种结构，为脂类生物碱的定性研究以及今后研究脂类生物碱在炮制、配伍中的变化规律提供了一种高效、快速的方法。

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AnalysisoftheLipo-AlkaloidsfromAconiteRootbyElectrosprayTripleQuadrupoleMassSpectrometry

GE Jing-cheng1, XU Qing-xuan2, YAN Jing1, CHEN Jian1,HE Yan-yu1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Haerbin150040,China;2.HeilongjiangUniversity,CropsResearchInstitute，Haerbin150081,China)

Aconite tuber is one of the commonly used Chinese traditional medicine. Lipo-alkaloids is the most important active ingredients in Aconite tuber. A stable, efficient and reliable method was established to quickly analysed the lipo-alkaloids which are rather complex in aconite tuber. The lipo-alkaloids in aconite tuber is analysed by using multiple scan function of electrospray ionization coupled with triple quadrupole mass spectrometry including full scan, daughter ion scan, parent ion scan and neutral loss scan. There are two kinds of differences in the lipo-alkaloidal structures, one in which base on the different alkaloid skeleton, the other difference is due to the connected with C8 substituted long chain fatty acids. The lipo-alkaloids with the high content in aconite tuber are due to 4 kinds of alkaloids skeleton and 3 kinds of C8 substituted fatty acids, e.g. a total of 12 kinds of lipo-alkaloids which are analysed. People often only focus on the much reaction monitoring(MRM) function of the triple quardrupole mass spectrometry, ignore the other functions. The function of parent ion scan and neutral loss scan for analysis of the lipo-alkaloids from aconite root has scanning speed, high efficiency. The results are stable and reliable.

aconite tuber; lipo-alkaloids; electrospray ionization coupled with triple quadrupole mass spectrometry; parent ion scan; neutral loss scan.

O 657.63

A

1004-2997(2012)03-0123-06