细胞因子信号抑制因子3在小鼠肾炎进程中的表达*

许文频， 沈 楠， 张二娟， 李 敏， 李卫东

(北京大学医学部基础医学院药理学系， 北京 100191)

1000-4718(2012)07-1287-05

2012-02-01

2012-04-12

国家自然科学基金资助项目(No. 81173069)；北京市自然科学基金资助项目(No.7102100)

△ 通讯作者 Tel: 010-82802798；E-mail: lwdpharma@126.com

细胞因子信号抑制因子3在小鼠肾炎进程中的表达*

许文频， 沈 楠， 张二娟， 李 敏， 李卫东△

(北京大学医学部基础医学院药理学系， 北京 100191)

目的探索细胞因子信号抑制因子3(SOCS3)在小鼠肾炎进程中的表达变化规律和意义。方法采用含兔抗小鼠肾小球基底膜抗体的肾毒素血清(NTS)制备小鼠肾炎模型。在第10、15、20和25 d分别收集小鼠尿液并摘取肾脏。以蛋白尿水平、肾脏组织HE和Masson染色评价肾炎进程；采用免疫组化和Western blotting 法检测SOCS3蛋白表达变化，以及Janus激酶2(JAK2)和信号转导及转录激活因子3(STAT3)在小鼠肾炎进程中磷酸化情况。结果小鼠肾炎模型表现出典型的发病、进展与转归；SOCS3在肾炎进程中未出现立即随JAK2和STAT3磷酸化增多而表达增加的现象，仅在肾炎严重期(第20 d)表达增加(P<0.05)，在恢复期(第25 d)表达明显增加(P<0.01)。恢复期SOCS3表达显著增加，表现出抑制JAK2和STAT3磷酸化的作用。结论机体自身条件下，SOCS3的表达未立即随JAK2/STAT3磷酸化增多而增加，SOCS3对免疫性肾炎的保护作用可能主要在肾炎恢复期。

细胞因子信号抑制因子； 肾毒素血清； 负调控； 信号通路

细胞因子信号抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)家族是以SH2结构域为核心结构，C端具有保守的40个氨基酸模块——SOCS盒的胞浆蛋白分子家族[1]。该家族可在多种细胞内表达或诱导表达。该家族主要功能的发挥是通过蛋白中SH2结构与Janus激酶(Janus kinase，JAK)或细胞因子受体中磷酸化的酪氨酸相结合，抑制细胞因子信号转导级联反应。 SOCS3作为SOCS家族的重要分子，目前已有大量研究表明其可被多种炎症因子和抗炎因子诱导表达，如白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)、干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)、脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)等，从而负调控机体免疫应答反应而避免机体遭受免疫损伤[2]。炎症刺激产生的IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等炎症因子通过细胞膜表面受体激活JAK2/信号转导及转录激活因子3(signal trainsducer and activator of transcription 3,STAT3)，引起SOCS3的表达增多，是SOCS3表达上调的重要途径[3]。

免疫性肾炎是免疫性疾病中最严重的病症之一，该病患者的生活质量严重受影响。该疾病的重要病因是肾小球基底膜抗原抗体复合物沉积或对自身抗原产生抗原抗体反应，引起自身免疫细胞攻击而导致肾组织损伤。在肾炎损伤过程中SOCS3分子的表达情况，以及JAK2-STAT3-SOCS3信号通路在疾病发病过程中的作用未见报道。本实验以小鼠肾毒素血清(nephrotoxic sera，NTS)性肾炎模型[4]为基础，通过调节NTS剂量，得到可自愈的小鼠肾炎模型，以研究SOCS3分子在该病进程不同时点的表达规律和意义。

材 料 和 方 法

1动物

日本大耳兔3只，雄性，体重2.5 kg，C57BL/6小鼠40只，雌性，体重18～20 g，均由北京大学医学部实验动物中心提供。

2主要试剂

兔抗鼠SOCS3Ⅰ抗、兔抗鼠JAK2Ⅰ抗、兔抗鼠p-JAK2Ⅰ抗、兔抗鼠STAT3Ⅰ抗、兔抗鼠p-STAT3Ⅰ抗和HRP标记抗兔Ⅱ抗为Cell Signaling Technology产品；羊抗鼠SOCS3Ⅰ抗为Santa Cruz产品； HRP标记抗羊免疫组化检测Ⅱ抗和DAB显色试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；完全弗氏佐剂、兔IgG和NP-40为Sigma产品；苯甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)、抑肽酶(aprotinin)和亮抑酶肽(leupeptin)为Amresco产品。ECL试剂盒为Thermo产品；Masson染色试剂盒为福州迈新生物技术开发有限公司产品。

3方法

3.1小鼠NTS的制备[4]取C57BL/6小鼠肾皮质，研磨过60、80、200目细胞筛，在200目细胞筛上面收集肾小球，将肾小球匀浆后制成混悬液。取肾小球匀浆液(蛋白浓度：200 g/L)与弗氏完全佐剂1∶1混合于第1、7和21 d皮下注射免疫兔，于第50 d收集兔血清即为NTS，检测NTS中总IgG含量。

3.2分组及造模 40只C57BL/6小鼠随机分为2

组，每组20只，即对照组和模型组。小鼠肾炎的制备：皮下注射兔IgG(250 μg/只)和弗氏完全佐剂混合液，于第4、5和6 d分别静脉注射给予NTS(100 μg总IgG/只)。对照组用空白兔血清取代NTS，其它处理与模型相同。分别于第10、15、20和25 d每个时点随机选择5只小鼠，体外压迫膀胱法收集小鼠尿液，然后断头处死，摘取肾脏。

3.3小鼠尿蛋白检测 考马斯亮蓝G250染色法检测小鼠尿蛋白含量。

3.4肾组织病理检测 取小鼠肾脏于液氮冷冻30 s后用OTC包埋，冰冻切片机切片，片厚6 μm。HE染色，Masson染色(步骤参照试剂盒说明书)，观察肾组织病理变化。

3.5肾组织兔抗小鼠肾小球抗体沉积检测 用HRP标记的抗兔抗体孵育，DAB显色，观察兔抗鼠肾小球基底膜抗体沉积情况。

3.6肾脏JAK2-STAT3-SOCS3信号通路相关蛋白检测

3.6.1免疫组化方法检测肾脏冰冻切片SOCS3的表达 两步法检测：取肾组织冰冻切片，丙酮固定后，37 ℃烤片3 h，3%过氧化氢孵育10 min，BSA封闭1 h，Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，Ⅱ抗37 ℃孵育30 min，DAB显色，用Image-Pro Plus软件半定量分析。

3.6.2Western blotting检测小鼠肾脏SOCS3表达和JAK2、STAT3磷酸化 组织蛋白提取：肾脏组织100 mg加入500 mL蛋白裂解液中，匀浆器匀浆，12 000×g4 ℃离心20 min取上清，考马斯亮蓝G250染色法检测蛋白含量，分装后-80 ℃冻存。取蛋白，用裂解液调蛋白浓度至每组相等，加入5×loading buffer， 沸水煮6 min。取蛋白60 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，后转至PVDF膜上，BSA封闭1 h，Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，Ⅱ抗室温孵育1 h，用增强化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)检测，Bio-Rad软件半定量分析。

4统计学处理

结 果

1NTS肾炎模型病程中尿蛋白水平变化

与对照组比较，第15、20和25 d模型组蛋白尿水平均明显升高(P<0.01)，提示肾脏功能在第15 d即有损伤，见图1。

图1制备模型后不同时点小鼠尿蛋白水平的变化

2NTS肾炎模型病程中肾组织病理改变

HE染色结果显示，对照组小鼠肾小球囊间隙清楚，肾小管排列规则。模型组第10 d小鼠肾组织有炎症细胞浸润，但炎症损伤和间质水肿均不明显，在第15和20 d可以看到大量的炎症细胞浸润，肾间质严重水肿，肾小囊与周围组织粘黏，部分肾小球萎缩，部分肾小球因代偿作用而增大。第25 d可以看到间质水肿降低，肾小球周围炎症细胞浸润减少，炎症似进入恢复期，见图2。

Masson染色结果显示，不同时点的模型组比对照组肾小球周围纤维增多不明显，在第20和25 d中肾小球出现部分硬化,说明本次炎症损伤以间质水肿为主，肾小球硬化主要为局部硬化，纤维化不明显，见图3。

Figure 2. HE staining of mouse kidney tissues. A: control group； B:model group (day 10)； C: model group (day 15)； D: model group (day 20)； E: model group (day 25).

图2小鼠肾组织HE染色

Figure 3. Masson staining of mouse kidney tissues. A: control group； B:model group (day 10)； C: model group (day 15)； D: mo-del group (day 20)； E: model group (day 25).

图3小鼠肾组织Masson染色

3NTS肾炎模型病程中兔抗小鼠肾小球基底膜抗体沉积情况

模型组第10 d开始便呈现抗肾小球基底膜抗体明显沉积，并且在肾炎过程中沉积情况类似，模型组第10、15、20和25 d各时点沉积情况无明显差别，见图4。

4NTS肾炎模型病程中JAK2-STAT3-SOCS3信号通路相关蛋白表达

4.1免疫组化结果显示，肾脏组织SOCS3蛋白免疫组化染色表现棕色部分逐渐增多，第25 d最为明显，如图5。

4.2Western blotting 结果表明，肾炎开始阶段第10和15 d，JAK2/STAT3磷酸化明显升高(P<0.01)，但此时SOCS3的升高无统计学意义(P>0.05)。肾

炎转归期(第25 d)，SOCS3表达显著增多(P<0.01)，见图6。

Figure 4. The glomerular deposits of rabbit immunoglobulin with immunohistochemical staining. A: control group； B:model group (day 15).

图4免疫组化染色检测小鼠肾小球兔免疫球蛋白沉积

图5免疫组化染色检测肾组织SOCS3表达

图6Westernblotting检测肾组织SOCS3表达以及JAK2/STAT3磷酸化情况

讨 论

免疫性肾炎病程漫长，发病机制与自身免疫系统对肾组织损伤相关。目前常用的自发性免疫性肾炎动物模型如BXSB、MRL/lpr小鼠等，这些肾炎模型随小鼠月龄增加日益严重，最终死亡，没有出现肾炎转归，愈合。而人类肾炎疾病多数是发病在一定期间内愈合。NTS鼠肾炎模型是通过静脉注入含有抗鼠肾小球基底膜抗体的肾毒素血清，通过抗原抗体反应而诱导的自身免疫系统损伤肾脏组织，而诱发的肾炎模型，病因清楚，条件可控。本实验通过调节NTS的剂量而制备出可以在一定时间内自愈的肾炎模型。本实验模型在第10 d没有出现明显肾炎损伤，而在第15和20 d时出现显著肾脏病理改变，并且炎症损伤在第25 d时有消退趋势，模拟了可自愈的免疫性肾炎的过程，因而可以观察在整个肾炎发病过程中目标蛋白的表达情况。本模型由于时间较短，肾炎的损伤以急性损伤为主，主要表现为间质水肿，肾小球与周围组织黏连，部分肾小球萎缩、硬化,纤维化不是很明显。本实验中JAK2/STAT3在肾炎的发展过程中出现随炎症程度增高而激活增加的趋势。SOCS3并没有表现出此趋势，而在炎症损伤最为严重的第20 d表达增加，并在炎症开始消退的第25 d显著增加。此实验结果提示我们SOCS3在肾炎愈合期发挥重要作用，这也说明免疫性肾炎自我恢复是有自身信号转导负调控参与的，而且负调控的启动可能与炎症的发生有时间差，或者达炎症刺激阈值才能诱导有效地负调控应答反应。本实验免疫组化结果表明SOCS3在第15 d表达增加也有统计学意义，但Western blotting检测没有统一的结果，说明可能是SOCS3在第15 d也有局部增高现象，但对于整个肾脏来说增高不是很明显，SOCS3的表达可能由于局部炎症差异而出现表达变化。

目前肾炎的主要治疗方法是抗感染、利尿、抑制免疫[5]、阻断特异免疫细胞功能[6]、严重者进行透析等。研究[7]已发现JAK/STAT 信号通路与肾炎有重要关系，并且通过AG490阻断可以缓解症状，延长模型鼠寿命。本实验提示我们，提高肾组织SOCS3的表达，可能为治疗肾炎的有效方法。如果找到可以提高肾组织SOCS3的药物，可有效缩短肾炎过程，促使该疾病早日康复。在其它的免疫类疾病中如风湿性关节炎、免疫性肝炎，外源性补充SOCS3表现出良好治疗作用[3, 8]。这提示我们外源性补充 SOCS3可能也是治愈肾炎的有效手段。JAK-STAT信号通路在糖尿病肾病中高糖诱导的肾小管上皮细胞转化也发挥重要作用[9]，作为负调控蛋白SOCS3对于糖尿病肾病可能也会有治疗作用。

[1] Alexander WS, Hilton DJ. The role of suppressors of cytokine signaling (SOCS) proteins in regulation of the immune response[J]. Annu Rev Immunol, 2004,22(1):503-529.

[2] Qin H,Niyongere SA, Lee SJ, et al. Expression and functional significance of SOCS-1 and SOCS-3 in astrocytes[J]. J Immunol, 2008,181(5):3167-3176.

[3] Jo D, Liu D, Yao S, et al. Intracellular protein therapy with SOCS3 inhibits inflammation and apoptosis[J]. Nat Med, 2005,11(8):892-898.

[4] Xie C, Rahman ZS, Xie S, et al. Strain distribution pattern of immune nephritis: a follow-up study[J]. Int Immunol, 2008,20(6):719-728.

[5] Leavy O. Autoimmunity: New players in lupus nephritis[J]. Nat Rev Immunol, 2010,10(7):464-465.

[6] Garcia-Carrasco M, Mendoza-Pinto C, Sandoval-Cruz M, et al. Anti-CD20 therapy in patients with refractory systemic lupus erythematosus: a longitudinal analysis of 52 Hispanic patients[J]. Lupus, 2010,19(2):213-219.

[7] Wang S, Yang N, Zhang L, et al. Jak/STAT signaling is involved in the inflammatory infiltration of the kidneys in MRL/lpr mice[J]. Lupus, 2010,19(10):1171-1180.

[8] Shouda T, Yoshida T, Hanada T, et al. Induction of the cytokine signal regulator SOCS3/CIS3 as a therapeutic strategy for treating inflammatory arthritis[J]. J Clin Invest, 2001,108(12):1781-1788.

[9] 赵 松, 史永红, 段惠军. JAK/STAT信号途径参与高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化[J]. 中国病理生理杂志, 2008,24(2):325-329.

Expressionofsuppressorofcytokinesignaling3duringthecourseofmousenephritis

XU Wen-pin, SHEN Nan, ZHANG Er-juan, LI Min, LI Wei-dong

(DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100191,China.E-mail:lwdpharma@126.com)

AIM: To explore the expression and role of suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) in mouse nephritis.METHODSC57BL/6 mice were challenged with rabbit anti-mouse glomerular basement membrane nephrotoxic sera (NTS) to induce immune nephritis. On days 10, 15, 20 and 25, the urine samples from the mice were collected, and the kidneys were also harvested. The degree of proteinuria and the changes of renal pathology were detected to assess the course of nephritis. The expression of SOCS3 and the phosphorylation of Janus kinase 2 (JAK2) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in the kidney were determined by Western blotting and immunohistochemical method.RESULTSIn model group, the severity of pathological changes increased over time by determining the proteinuria levels and observing the kidney pathological sections. However, the nephritis was improved on day 25. The expression level of SOCS3 did not change with the phosphorylation of JAK2/STAT3 immediately, but became increased when the disease was severer and got to a significantly higher level in convalescence.CONCLUSIONThe expression level of SOCS3 does not increase immediately after the remarkable phosphorylation of JAK2/STAT3, and the protective effect of SOCS3 in nephritis might occur in convalescence.

Suppressor of cytokine signaling; Nephrotoxic sera; Negative regulation; Signaling pathways

R364.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.025