组织工程支架材料——交联透明质酸置入角膜生物相容性研究

2012-11-06 08:52胡勇平张惠成刘小玲
医学研究杂志 2012年7期
关键词:透明质角膜基质

郝 念 胡勇平 张惠成 刘小玲 董 映

角膜病是常见的致盲性眼病,绝大部分患者可以通过角膜移植而复明,但由于角膜捐献数量非常有限,绝大部分患者因得不到移植角膜而无法复明[1]。近年来,新兴的角膜组织工程给众多的角膜病患者带来复明的希望。角膜组织工程重建的技术关键是形成角膜上皮细胞、基质细胞、内皮细胞和支架载体的三维复合体。故支架载体材料是组织工程学研究的主要内容,也是组织工程构建角膜的必要条件之一[2]。然而选择合适的材料作为载体支架仍是困扰此项技术开展的难题,至今未有实质性突破[3]。透明质酸(hyaluronic acid,HA)作为一种可吸收降解、相容性良好的生物材料,已广泛应用于临床。但透明质酸材料质地柔软,机械强度差,尚无法作为支架材料运用于组织工程重建。本研究尝试化学交联合成高强度的交联透明质酸材料,制备组织工程支架材料置入兔角膜层间,观察交联透明质酸材料的生物相容性,探讨其作为角膜组织工程支架材料可行性。

材料与方法

1.实验动物及分组:雄性新西兰白兔18只(杭州师范大学实验动物中心提供),8周龄,体重2.5~3.0kg,随机分为两组,实验组(n=9):每只兔眼角膜基质层间置入交联透明质酸材料;对照组(n=9):仅制作角膜层间囊袋,不置入材料。术前检查兔眼前节正常。

2.支架载体材料:(1)交联透明质酸的制备:采用药用级透明质酸100g,4℃加水溶胀过夜,配置成10%透明质酸钠1000ml溶液待用。按照如下配方配置交联反应液A,其组分和重量百分比的含量:BDDE(丁二醇二缩水甘油基醚):30ml,氢氧化钠溶液0.5mol/L:50ml,加蒸馏水至500m l。将交联反应液A加入透明质酸溶液,在40℃,反应6h,即得初步交联产物,用蒸馏水反复洗涤4次,再加入二步交联液B。二步交联液B的组分和重量百分比的含量:DVS(二乙基砜)10m l,碳酸钠/碳酸氢钠溶液 0.8mol/L:50ml,pH=10,加蒸馏水至500ml,继续反应4h,用蒸馏水洗涤,再加入0.5g/L的甘氨酸溶液1000ml浸泡2.5h,蒸馏水充分洗涤,干燥后备用。(2)交联透明质酸支架材料的制备:将上述制备的交联透明质酸材料切割成直径为5.0mm,高为4.0mm的圆柱体,采用病理切片机将圆柱体切片成厚度为30μm直径为5.0mm的圆片,将圆片贴附于直径为5.0mm×5.0mm的载玻片上,用环氧乙烷灭菌备用。

3.动物实验过程:所有新西兰白兔用氯胺酮(50mg/kg)和氯丙嗪(25mg/kg)混合肌内注射麻醉,均以右眼为术眼,1%丁卡因滴眼表面麻醉,消毒铺巾开睑器开睑。用尖刀片于实验组兔右眼上方角巩膜缘内侧1.5mm透明角膜做一长3.0mm,深约1/2角膜厚度的切口,月形刀伸入切口在角膜基质层内分离出直径约8.0mm的囊袋。将消毒备用的交联透明质酸支架材料置入角膜囊袋内展平,角膜囊袋切口自然复位(图1A)。对照组兔右眼仅制作角膜板层囊袋,不置入材料。术毕妥布霉素地塞米松眼膏涂眼,术后妥布霉素地塞米松眼水滴眼3次/天,持续7天。

4.眼部一般情况观察:术后1周、2周、1个月、2个月、3个月裂隙灯显微镜观察术眼角膜愈合情况,有否角膜支架材料脱出、角膜混浊,包括角膜新生血管、排斥反应等发生。

5.角膜组织学观察:分别于术后2周、1个月、3个月处死两组白兔,即刻摘取术眼固定于中性甲醛液中。角膜组织经常规固定脱水、石蜡包埋切片、HE染色,光镜下观察。各时间点处死的动物:两组均为3只兔。

6.角膜扫描电镜观察:将上述步骤取材的术眼角膜组织经20%戊二醛固定,缓冲液漂洗,锇酸固定1.5h后乙醇脱水,喷金后进行扫描电镜观察。

结 果

1.眼部一般情况:术后1~3天,实验组及对照组均可见球结膜轻度充血,手术区域角膜上皮轻度水肿,结膜囊有少许分泌物,所有反应于术后1周内逐渐减轻并消失。观察期内实验组及对照组角膜透明,上皮完整,未见角膜新生血管长入,兔眼角膜内交联透明质酸植片在裂隙灯下透明状(图1B、图1C)。所有兔眼均未见角膜坏死、角膜溃疡及置入材料脱出。

图1 材料置入后的实验组兔眼

2.角膜组织学观察:术后2周,在置入材料周围可见少量的单核细胞以及少量中性白细胞,未见有明显坏死组织和淋巴细胞浸润。术后1个月,上述部位未见明显炎性细胞浸润,材料置入部位的角膜基质纤维走向与周围基质相比较紊乱(图2A)。术后3个月,有1例兔眼可见置入角膜基质部位少量新生血管(图2B),周围的基质胶原染色较深,其余兔眼可见角膜胶原纤维排列整齐,置入部位不能辨认,切口愈合。整个观察期内未见置入物析出和异物包裹现象。角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞的排列和形态均未见明显改变。对照组术后2周兔角膜可见轻微炎性反应,在其他观察时间点,角膜内未见炎性细胞,胶原纤维排列整齐,纤维染色未见异常。

图2 材料置入术后实验组兔角膜组织切片

3.角膜扫描电镜观察:实验组各个时期的角膜胶原纤维排列较规则,胶原纤维间未见明显的析出物,术后3个月发生角膜新生血管的兔角膜中可见胶原纤维间有潜在间隙,其内有碟形的红细胞存在(图3A,3B),在其两侧角膜基质中胶原纤维排列无明显变化。

图3 材料置入术后3个月实验组兔角膜电镜照片

讨 论

角膜组织工程利用组织工程学技术,将培养的种子细胞种植于合适的载体支架上,体外构建一个近似正常的角膜组织,最终替代病变的角膜组织。1993年Minami等[4]在胶原凝胶中加入培养的角膜基质细胞,而后将牛角膜内皮、上皮细胞分别种植在凝胶的底部和上部继续培养,首次体外成功构建三维牛角膜组织,将体外角膜重建变为现实。但上述重建的角膜组织是以胶原凝胶作为支架材料,存在机械强度和韧性不足,透明度低等缺陷无法进一步运用临床。此后研究人员尝试选用羊膜、合成胶原、异种脱细胞角膜基质以及人工合成材料等作为角膜组织工程重建的支架材料,但都因为以上生物或合成材料存在各种缺陷,角膜组织工程重构仍停留于实验研究阶段[5~9]。角膜体外重建支架材料不仅要有一般支架材料良好的生物相容性、立体三维结构、生物可降解性、良好的细胞生长界面、可塑性及机械强度这些基本要求,还要能满足角膜透明屈光、透氧等特殊要求,因此寻求理想的支架材料是角膜组织工程重建亟待解决问题之一[10,11]。

透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种独特的线性大分子黏多糖,由葡萄糖醛酸和N—乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成。HA广泛分布于动物和人体结缔组织细胞外基质中。它与其他天然黏多糖不同,不与蛋白质共价结合,不存在引发抗原反应的基团,有良好的生物相容性,体内可生物吸收降解,是一种理想的天然生物材料。目前透明质酸或其衍生物运用于外科手术防粘连、促进伤口愈合、骨关节炎症治疗以及缓释药物载体等方面[12]。眼科方面,透明质酸运用已久,如白内障手术中常用的黏弹剂。此外临床研究发现在非穿透性小梁手术中应用透明质酸生物胶能有效抑制青光眼滤过术后瘢痕形成,维持稳定眼压。

虽然透明质酸已广泛运用临床,若以透明质酸作为角膜组织工程重建支架材料,由于存在质地柔软,机械强度差等缺陷,不符合角膜组织工程重建支架材料的要求。本研究采用交联改性方法,使透明质酸材料的物理性状改善,满足角膜重建支架材料物理强度要求。透明质酸经过二次化学交联,生物相容性有否改变,对机体组织细胞有否毒性等情况尚不明确。生物相容性的评价是生物材料进入临床实验前必不可少的关键环节,生物材料必须具备良好的生物相容性才能确保后期临床应用的安全性。因此我们将交联透明质酸材料置入兔角膜层间,用以观察评价透明质酸交联改性后的生物相容性。实验结果显示交联透明质酸材料置入后耐受良好,无纤维包裹及排出。在各时间点的组织学检查中均未发现明显炎性细胞浸润,置入物两侧的角膜基质纤维排列无明显变化,角膜上皮及内皮保持完整,表明此材料有良好的生物相容性。此外通过裂隙灯检查中可以看到,兔眼角膜在植入交联透明质酸材料后保持透明,表明此材料不仅有良好的生物相容性,而且满足角膜组织工程支架材料需要良好透明屈光特性这一特殊要求。实验结果显示,交联透明质酸材料具有成为角膜组织工程体外重建支架材料可能,而深入研究如种子细胞与支架材料三维培养,动物移植模型实验尚在进行之中。

此外,由于交联透明质酸具有良好的生物相容性以及透明屈光性,尚有可能成为人工角膜、人工晶体以及视网膜脱离复位手术的眼外加压材料替代品,在眼科具有广阔的发展前景,具有研究开发价值。

1 刘祖国,张慧.重视我国角膜病的基础研究[J].中华眼科杂志,2006,42(8):673 -675

2 丁勇,徐锦堂,吴春云,等.新型可降解支架材料植入角膜的生物学反应研究[J].眼科研究,2004,22(2):117 -120

3 范先群.组织工程角膜的研究现状和存在的问题[J].上海交通大学学报(医学版),2008,28(6):619 -621

4 Minami Y,Sugihara H,Oono S.Reconstruction of cornea in threedimensional collagen gelmatrix culture[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1993,34(7):2316 - 2324

5 傅瑶,范先群,罗敏,等.羊膜载体培养标记兔角膜内皮细胞移植的研究[J].中华眼科杂志,2006,42(10):925 -929

6 Mmiura T,Yamagami S,Yokoo S,etal.Cultured human corneal endothelial cell transplantation with a collagen sheet in a rabbit model[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45(9):2992 -2997

7 Zhou Y,Wu Z,Ge J,et al.Development and characterization of acellular porcine cornealmatrix using sodium dodecylsulfate[J].Cornea,2011,30(1):73 -82

8 Shmimura S,Miyashita H,Konomi K,et al.Transplantation of corneal endothelium with Descemets'membrane using a hyroxyethyl methacrylate polymer as a carrier[J].Br J Ophthalmol,2005,89(2):134-137

9 Lai JY,Chen KH,Hsiue GH.Tissue-engineered human cornea l endothelial cell sheet transplantation in a rabbitmodel using functional biomaterials[J].Transplantation,2007,84(10):1222 - 1232

10 Leong KF,Cheah CM,Chua CK.Solid freeform fabrication of three-dimensional scaffolds for engineering replacement tissues and organs[J].Biomaterials,2003,24(13):2363 -2378

11 Stella JA,D'Amore A,Wagner WR,et al.On the biomechanical function of scaffolds for engineering load - bearing soft tissues[J].Acta Biomater,2010,6(7):2365 -2381

12 Lee H,Lee K,Park TG.Hyaluronic acid-paclitaxel conjugate micelles:synthesis,characterization,and antitumor activity[J].Bioconjug Chem,2008,19(6):1319 -1325

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