基于气相色谱－质谱的肥胖抵抗大鼠尿液代谢组学研究

辛衍代 季 虹 刘兴艳 张 丽 荣海钦

代谢组学的研究方法能对生物流体中的代谢产物和代谢中间物进行定性定量分析，发现由疾病过程引起的代谢异常，帮助人们更好地理解病变过程及机体内物质的代谢途径，还有助于疾病的生物标志物的发现和辅助临床诊断的目的［1，2］。气相色谱－质谱(GC－MS)联用技术具备较为完善的质谱数据库，其操作简便，且具有较强的分离分析能力，已得到广泛的应用［3，4］。由生活因素特别是高糖高脂饮食导致的肥胖型2型糖尿病等代谢性疾病已引起人们的高度重视，而肥胖抵抗型2型糖尿病等代谢性疾病目前研究较少。尿液是整体代谢终产物输出的主要途径之一，尿液中代谢物的波动不仅能够反映机体整体代谢的特征，还可能是局部组织或器官功能异常的外在表现，且尿液样品的收集无创、方便等特点使操作简便易行。本研究建立了一套基于GC－MS技术的代谢组学分析方法，用于研究高糖高脂饮食导致的肥胖抵抗Wistar大鼠模型的物质能量代谢特点。大鼠尿液经样品前处理之后进行GC－MS分析，采集的数据经过峰匹配、归一化校正、正交信号校正技术(OSC)滤噪后进行多变量分析，寻找差异代谢物，以对非肥胖型2型糖尿病等代谢性疾病的的发病机制有更深入的了解。

在对养路机械进行设备点检的过程中，为确保点检工作落到实处，应对点检结果进行查验，进而避免设备点检中出现虚假查验问题，保障点检工作的认真落实。在进行设备点检检查管理时，主要是对点检的结果进行查验，并利用赏罚分明的点检管理制度进行谎检问题进行严肃的处理。

材料与方法

1．试剂和仪器:尿酶(172U/mg，TOYOBO)、甲醇(色谱纯，TEDIA)、吡啶(色谱纯，Fluka)、正庚烷(色谱纯，科密欧)、BSTFA(ALDRICH)。气相色谱－质谱联用仪(Agilent 7890A－5975C)，配有自动进样器，高速低温离心机(Eppendorf Centrifuge 5417R)。高糖高脂饲料:20%动物脂肪，5%的葡萄糖，5%的果糖，5%的胆固醇，其他的为基础饲料。

2．肥胖抵抗大鼠模型的建立:选用雄性Wistar健康大鼠，体重250±20g，从山东大学实验动物中心购买。适应性喂养1周后随机挑选8只大鼠喂养基础饲料，作对照组(CR)，其他20只喂养高糖高脂饮食，16周后称体重，按照体重增加量再次排序，上1/3大鼠(7只)为肥胖组大鼠，与中间1/3大鼠(6只)均剔除，下1/3大鼠(7只)为肥胖抵抗组大鼠(OR)，即本研究的实验对象［5］。为测定相关指标，把对照组及肥胖抵抗组大鼠放入代谢笼收集24h尿液，－20℃保存［6］。并禁食8h后尾静脉采集空腹血，测生化指标。

3．样品前处理:取200μl尿于1．5m l离心管中，加20μl尿酶的磷酸盐缓冲液(50mg/ml)，37℃反应30min，以去除尿中的尿素，加 600μl甲醇，震荡混匀，超声 30s，－20℃ 放置10min，高速离心机离心(4℃，转速 10000r/min)，10min，取上清液400μl，真空干燥，加入50μl甲氧胺的吡啶溶液(15mg/m l)，25℃肟化 16h，加 40μl BSTFA，70℃ 衍生 30min，加 70μl正庚烷混匀，离心取上清，准备分析［7］。

5．数据处理:根据GC－MS总离子流图中各峰的保留时间进行峰匹配，峰面积经归一化法校正后导入SIMCA－P11．5(Umea，Sweden)进行多变量分析，得到的可能标志物导入到SPSS 11．5进行非参数检验(Mann－Whitney U，P ＜0．05)［8］。利用NIST质谱数据库对可能标志物做鉴定，通常匹配度＞800(最高值1000)且可能性＞80%的鉴定结果较为可信［9］。

1．尿酶加入量的确定:同一尿样，分别加入5、10、20μl尿酶，其余处理方法相同。经过GC－MS分析发现，加入20μl尿酶能把尿液中含有的大部分尿素去除，效果较好，因此本实验尿酶加入量为20μl(图3)。

针对强蚀变岩洞段呈很湿或饱和状情况时，在掌子面和护盾位置极易形成大面积塌方或流沙，此时TBM掘进和支护均无法施做，且存在卡机危险。为了确保施工安全，应首先对该位置进行超前预注浆加固，由于普通浆液存在固结刀盘风险，本洞段采用化学灌浆，化学灌浆材料由A、B两种组份构成，二者比例为1∶1。

结 果

1．生化指标:高糖高脂饮食干预16周之后，称重、测空腹血生化指标。肥胖抵抗组体重并未有显著变化(331±30g vs 303±45g)，但是空腹胰岛素、血糖均显著升高(P＜0．05)，表明肥胖抵抗大鼠已发生了胰岛素抵抗和糖代谢紊乱。低密度脂蛋白、总胆固醇显著升高(P＜0．05)，高密度脂蛋白显著下降(P＜0.05)，而甘油三酯却显著下降(0．68±0．15mmol/L vs 0．42 ±0．17mmol/L，P ＜0．05，表 1)。这说明肥胖抵抗大鼠的脂代谢也已发生紊乱，研究发现2型糖尿病人胰岛素抵抗和超低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白有密切的关系［10］。糖、脂代谢异常表明代谢紊乱的模型建立成功。

表1 肥胖抵抗组和对照组生化指标

为克服上述困难,人们将大量的碳纳米管通过一定方式组装成一维连续的纤维[5-7].采用传统纤维复合材料制备工艺,可以获得高取向、高含量碳纳米管复合材料.进入21世纪以来,人们先后开发了溶液纺丝法、碳纳米管阵列纺丝法,以及化学气相沉积直接制备法等碳纳米管纤维制备方法,同时也对碳纳米管纤维的力学、电学和热学性能进行了系统研究.初步的研究结果表明,碳纳米管纤维的比强度和比刚度均超过了已有碳纤维,其强度已高达8.9 GPa,而且具有和碳纤维相比更优异的导电和导热特性[6].

2．GC－MS数据的多变量分析:GC－MS采集的数据经峰匹配、归一化校正之后进行多变量分析。主成分分析(PCA)是一种无师监督模式识别方法，可以直观地在多维空间上描述样品间的差异。从图1可以看出质控样本较好的聚合在一起，说明本实验的分析误差小于样本间的固有差异。但是对照组和肥胖抵抗组的差异不明显，这主要是由于尿样在收集过程中会产生多余的干扰因素，需要对数据进行滤噪处理［11］。正交信号校正技术(OSC)能滤掉与类别判断正交的变量信息，消除多余的干扰因素，有利于模式识别分类的成功［2］。数据经OSC滤噪之后进行了最小二乘判别分析(PLS－DA)，由图2A可看出，对照组和肥胖抵抗组大鼠分别在不同的区域，具有较大的差别，模型的 R2Y和 Q2值分别为 0．929和0.905，说明模型具有较好的预测能力。过拟合测试中R2截距和 Q2截距分别为0．0775和 －0．28，说明模型不存在过度拟合［12］。PLS－DA模型载荷图(图2B)反映了输出变量对样品分类的影响，距离载荷矩阵图中心远的为可能的生物标志物，对这些化合物做非参数检验，最终得到15个代谢物在正常对照组和模型组之间有显著性差异(P＜0．05，表2)。和对照组相比肥胖抵抗组大鼠尿中羟基乙酸、苏氨酸、丝氨酸、丁二酸、延胡索酸、2，3－二羟基－丁酸、苹果酸、羰基戊二酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸、葡萄糖醇、反式乌头酸、果糖、葡萄糖、肌醇含量减少。

图1 大鼠尿样的主成分分析得分图Class 1．正常对照组;Class 2．肥胖抵抗组;Class 3．质控样品

讨 论

4．分析条件:进样 1μl，分流比 10∶1。色谱柱:DB －5MS(30m ×0．25mm ×0．25μm)。柱温:70℃持续 2min→以 7℃ /min的速度加热至180℃→以5℃/min的速度加热至250℃→以25℃/min的速度加热至290℃，然后再持续10min。进样口温度:270℃。接口温度:280℃。离子源温度:230℃。载气:氦气。载气流速:40cm/s。电离方式:EI。电子能量:70eV。扫描范围:40～500m/z。

其中，Bi的11次载气空白信号值均为零，默认其11次载气空白信号值的3倍标准偏差为1 CPS[11-13]，计算得到Bi的检出限为0.0065μg/g。综上所述，各元素的检出限为0.0065～0.31μg/g。

图2 大鼠尿样的OSC－PLS－DA分析的得分图(A)和载荷图(B)Class 1．正常对照组;Class 2．肥胖抵抗组

2．方法精准度的验证:取一尿样，分别取200μl尿于2个1．5ml离心管中，作为质控样品(QC)，与肥胖抵抗组、对照组一起进行样品前处理，建立分析序列进行GC－MS分析，每分析8个样品质控样品各进样1次，共6次。提取共有峰，计算相对标准偏差。表2列出的是质控样本中部分化合物的相对标准偏差，羰基戊二酸的相对标准偏差较大为11.77，其他的均在10%以内，重现性良好。

表2 肥胖抵抗组和对照组差异代谢物

图3 尿酶加入量的确定

3．高糖高脂干预后肥胖抵抗组大鼠尿液代谢组学差异:尿液是人体整体代谢终产物输出的主要途径之一，尿液中代谢物的波动不仅能够反映机体整体代谢的特征，还可能是局部组织或器官功能异常的外在表现。研究发现糖调节受损的大鼠尿液中肠道菌群的代谢物(二甲胺、三甲胺)的浓度升高，认为肠道菌群的改变可能和胰岛素的抵抗有关系。本实验发现肥胖抵抗组大鼠尿液中对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸显著减少，它们是肠道菌群代谢饮食中的芳香族氨基酸和多酚类物质的产物，它们的减少表明长期的高糖高脂饮食可能改变了宿主的肠道菌群的结构，这可能和胰岛素抵抗有关系。三羧酸循环是三大营养物质氧化供能的共同代谢途径，三羧酸循环的状况是机体能量代谢水平的综合反映。丁二酸、延胡索酸、羰基戊二酸、苹果酸是三羧酸循环主要的中间代谢物，它们减少，表明饮食干预组大鼠出现胰岛素抵抗，糖酵解减弱，能量代谢出现异常。苏氨酸、丝氨酸减少，表明氨基酸代谢出现异常，韩晓菲等研究发现氨基酸代谢谱与糖尿病患者血糖高低之间存在相关性，且苏氨酸等7种氨基酸代谢与血糖高低密切相关，有研究显示这可能和肾小管受损有关。本实验结果显示肥胖抵抗组尿液中肌醇含量较对照组明显减少，提示肌醇代谢明显异常。肌醇具有类似于维生素B1和维生素H(生物素)的作用，是人类与动物维持正常生理功能不可缺少的低分子有机物，能促进肝和脂肪的代谢，肌醇的耗竭也将影响肾小管上皮细胞正常的生理功能，引起细胞肥大，抑制细胞增殖并促进前胶原的合成与分泌，引起肾间质的纤维化而不可逆的，严重者进展为终末期肾衰竭。Nissen等通过动物实验证实肌醇与成年后糖耐量低减及胰岛素抵抗有关联。

本实验研究建立了GC－MS代谢组学分析方法，并将其应用高糖高脂饮食干预的非肥胖型大鼠尿液的代谢指纹分析。GC－MS采集的数据经峰匹配、归一化校正之后进行多变量分析，模型具有很好的预测能力，R2Y和 Q2值分别为 0．929和 0．905，发现 15个代谢物含量异常，血清生化指标也出现异常，表明在经过高糖高脂饮食干预16周之后，Wistar大鼠虽然体重没有明显变化，但是糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢发生异常，而且肠道菌群的结构也可能发生变化，这对非肥胖型代谢性疾病，尤其是非肥胖型2型糖尿病的发病机制的研究有重要意义。

1 Holmes E，Wilson ID，Nicholson JK．Metabolic phenotyping in health and disease［J］．Cell，2008，134(5):714 －717

2 Li X，Lu X，Xu G，et al．Comprehensive two－ dimensional gas chromatography/time－of－flightmass spectrometry formetabonomics:Biomarker discovery for diabetesmellitus［J］．Analytica Chimica Acta，2009，633(2):257 －262

3 Zheng XT，Shen J，Liu Q，etal．Plasma fatty acidsmetabolic profiling analysis of coronary heart disease based on GC－MS and pattern recognition［J］．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2009，49(2):481－486

4 Qiu Y，Su M，Jia M，etal．Application of ethyl chloroformate derivat-ization for gas chromatography－mass spectrometry basedmetabonomic profiling［J］．Analytica Chimica Acta，2007，583(2):277 －283

5 Levin BE．Arcuate NPY neurons and energy homeostasis in diet－induced obese and resistant rats［J］．Am JPhysiol，1999，276(2):382 －387

6 孙晖，孙文军，杨昆，等．基于临床化学及代谢组学的实验性2型糖尿病大鼠模型评价研究［J］．中国中医药，2010，8(10):1

7 Jiye A，Trygg J，Gullberg J，et al．Extraction and GC/MS analysis of the human blood plasma metabolome［J］．Anal Chem，2005，77(24):8086－8094

8 Qiu Y，CaiG，JiaW，etal．Serum metabolite profiling of human colorectal cancer using GC－TOFMS and UPLC－QTOFMS［J］．Journal of Proteome Research，2009，8(11):4844－4850

9 Major HJ，Williams R，Wilson AJ，et al．A metabonomic analysis of plasma from Zucker rat strains using gas chromatography/mass spectrometry and pattern recognition［J］．Rapid Commun Mass Spectrom，2006，20(22):3295－3302

10 Pereira S，Marliss EB，Morais JA，et al．Insulin resistance of protein metabolisMin type 2 diabetes［J］．Diabetes，2008，57(1):56 －63

11 卢红梅，梁逸曾．代谢组学分析技术及数据处理技术［J］．分析测试学报，2008，27(3):325 －332

12 袁凯龙，石先哲，路鑫，等．洛沙坦治疗糖尿病的气相色谱代谢组学［J］．中国医学科学院学报，2007，29(6):719 －724