病毒核酸联合抗心肌抗体检测对病毒性心肌炎诊断的意义

曹悦群，张淑芹，刘志屹，吴金义

（1.长春师范学院，吉林 长春130032；2.吉林大学再生医学科学研究所，吉林 长春130021；3.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033）

病毒性心肌炎是由多种因素引起的，病毒感染是其发病的直接诱因。目前，已知近30多种病毒可引起病毒性心肌炎，其中以柯萨奇B组病毒为主。病毒感染机体后导致心肌损伤，导致心肌成分在血液循环中暴露，产生相应的心肌抗体。而心肌抗体的产生又会加重心肌的损伤。本文对500例疑似病毒性心肌炎患者血清进行了柯萨奇B组病毒核酸以及抗心肌抗体的检测与分析，为病毒性心肌炎的诊断与治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人羊膜细胞，柯萨奇B组病毒1－6型标准株（本室保存）。

1.2 病例来源 2011年1－9月份经吉林大学中日联谊医院诊断的疑似病毒性心肌炎患者500例。其中病程少于2周者103人，病程介于2－4周之间者254人，病程超过4周以上者143人。患者常常先有发热，全身倦怠、恶心、呕吐等感冒症状，然后出现心悸、胸痛、呼吸困难，心动过速、心律失常等体征。心电图可见ST－T改变，R波减低、房室传导阻滞以及室性早搏。血清学检查CPK、GOT、LDH增高，血沉加快，白细胞增多。健康对照组100例，来自健康普查人群。

1.3 试剂和仪器 Trizol裂解液、限制性内切酶HindⅢ、PstⅠ、NcoⅠ、ScaⅠ和SphⅠ均购于美国GIBCO／BRL公司；TagDNA 聚合酶，购于美国SIGMA公司；NCPCO二氧化碳培养箱购于美国医疗仪器公司；冷冻高速离心机购于德国SIGMA公司；PCR仪购于日本ASTZC公司。IX71组织显微镜，日本；电泳仪，BIO－RAD。Tanon－2500R型凝胶成像仪，上海天能科技有限公司。

1.4 引物的设计：上游引物 B5P2：5＇－CGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTT－3＇，下 游 引 物 B3P：5’－TCAATTGTCACCATA－AGCAGCCA－3’，这对引物用于扩增柯萨奇B1－B6型病毒第64－610位核苷酸，扩增产物为547 bp。

1.5 病毒核酸检测 按文献［1］常规方法对样本进行RT－PCR，然后按照文献［2］选择先前设计的一种以NEBuffer2为基质的 HindⅢ、PstⅠ、NcoⅠ、ScaⅠ和SphⅠ混合内切酶检测溶液，将待测样品的cDNA在NEBuffer2中被这5种限制性内切酶切割，然后将酶切后产物的电泳图谱和标准图谱进行对比分析。

1.6 抗心肌抗体的检测 以小鼠心肌组织冷冻切片作为抗原基质的间接免疫荧光法［3］进行，结果鉴定以肌纤维膜以及肌纤维束肌浆呈现蓝绿色荧光者为阳性。

1.7 分析软件 利用美国Auelrys Inc公司的GCG软件进行分析。

2 结果

2.1 病毒性心肌炎患者柯萨奇B组病毒及抗心肌抗体的检测结果 结果如表1所示。试验中发现，500例疑似病毒性心肌炎患者血清中柯萨奇B组病毒的感染率为62.2%，其中B1感染率为1%，B2感染率为0，B3感染率为26.4%，B4感染率为18.2%，B5感染率为14.8%。B6感染率为1.8%，健康对照组的感染率仅为13%，并且都是B3感染率最高，B4、B5次之；500例疑似病毒性心肌炎患者血清中的抗心肌抗体的阳性率为46.7%，健康对照组的阳性率为7%，患病组与对照组比较，差异显著。

2.2 柯萨奇B组病毒核酸检测的阳性标本中抗心肌抗体的检测结果 如表2所示。试验结果显示，病毒感染的患者抗心肌抗体的检出率很高，平均可达到71.4%，病毒感染的病程不同，抗心肌抗体的检出率有所不同，病毒感染期小于2周的患者，其抗心肌抗体的检出率为40.3%，病毒感染期在2－4周之间的患者，其抗心肌抗体的检出率为70%，病毒感染期在超过4周的患者，其抗心肌抗体的检出率为90.8%，表明抗心肌抗体的阳性率随着病程的延长而增高。

表1 病毒性心肌炎患者血清柯萨奇B组病毒及抗心肌抗体的检测结果

表2 柯萨奇B组病毒核酸检测的阳性标本中抗心肌抗体的检测结果

3 讨论

病毒性心肌炎是多种嗜心性病毒感染心肌后引起的心脏实质或间质、局限性或弥漫性病变，其中柯萨奇B组病毒感染占病毒性心肌炎总数的50%以上。发病的年龄从胎儿、新生儿、一直到儿童和青少年等各个阶段。但是，患者绝大多数为儿童和青壮年，并且发病率有逐年上升的趋势［4］。

病毒性心肌炎的诊断目前仍以临床表现为主，并以心电图作为常规检查协助诊断。血液检查是以心肌酶谱作为心肌损伤的相关指标。病毒性心肌炎的急性期AST升高。1－2周开始升高，2－4周升高明显，可持续4－8周。LDH在心肌炎发病15 d内升高，后逐渐恢复正常。CK及CK－MB在心肌炎发病1－2周活性升高，3－5周逐渐下降。其中以CK、CK－MB敏感性和特异性最高，但如果病毒性心肌炎病变为局灶性，心肌坏死量小，则心肌酶谱变化较轻或不发生改变，而且心肌酶谱的变化缺乏足够的灵敏度和特异性，易造成漏诊或误诊［5］。

心肌抗体是心肌受累的标志。是心脏疾患时产生的自身抗体，是免疫机能介导、参与的病理过程。大量的临床和实验研究表明，病毒性心肌炎患者血清抗心肌抗体的阳性率与患病病程密切相关［6］。我们的研究结果也表明，柯萨奇B组病毒感染患者的抗心肌抗体阳性率很高，并且随着病程的延长，阳性率逐渐增高。这可能与病毒持续感染，导致机体免疫失衡所致。因此，抗心肌抗体的检测，不仅可以监测病情，还有助于判断预后。

病毒核酸检测一种灵敏度高，重现性好的检测方法。是在RT－PCR的基础上，利用特定的5种限制性内切酶对所获得的目的cDNA进行酶切消化，将酶切产物的电泳图谱和柯萨奇B组病毒1－6型的标准酶切图谱进行分析和对比，可以很容易地对感染的病毒及型别进行准确地鉴别。它不需要对每一个病毒型别都设计一对引物，只需要对病毒cDNA上共同的保守序列设计一对引物，然后通过RTPCR方法将柯萨奇B组病毒的RNA反转录并扩增成大量的特定cDNA，再进行酶切鉴定。因此，它既综合了常规PCR的灵敏度高的优势，在病毒感染2－3天即可检测到病毒核酸。可作为病毒感染早期诊断的依据。同时又解决了RT－PCR技术中非特异性高的难题，是一种更加适用、更加精确的检测方法。为病毒性疾病的早期诊断提供可靠的理论依据［7.8］。

本文对500例疑似病毒性心肌炎患者标本进行柯萨奇B组病毒核酸以及抗心肌抗体检测，其中病毒阳性者311例，阳性率为62.2%，与正常对照组比较具有显著性差异；说明病毒性心肌炎大多是由柯萨奇B组病毒引起，其中CVB3阳性率最高，CVB4、CVB5次之，这与国内外报道相一致。而抗心肌抗体检测阳性者233例，阳性率为46.7%。并且在311例病毒检测阳性标本中，抗心肌抗体检测阳性者222例，平均阳性率为71.4%。而且病程越长，阳性率越高，说明病毒的持续感染是造成心肌损伤的重要因素。

综上所述，病毒性心肌炎的血液检查中，除了心肌酶的检测外，加以病毒核酸以及抗心肌抗体的检测，对病毒性心肌炎的早期诊断、治疗和预后研判具有重要意义。

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［4］宁 娟，李永宏，病毒性心肌炎的发病机制［J］.医学综述，2008，14（9）：1349.

［5］裴 丽，张军平.病毒性心肌炎诊断的研究进展［J］.实用儿科临床杂志，2011，26（5）：795.

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［7］张淑芹，王国珍，刘志屹，等.限制性内切酶分析法对病毒感染性疾病诊断的意义［J］.中国实验诊断学，2008，12（11）：1367.

［8］孙 寒，张淑芹，刘志屹，等 .柯萨奇B组病毒三种检测方法的比较［J］.中国地方病防治杂志，2008，23（3）：176.