应用MTT检测乙酰唑胺对卵巢癌细胞的抑制作用

王艳丽，张小猛

（1.吉林大学第一医院 妇 产科，吉林 长 春130021；2.吉林大学第二医院 眼 科，吉林 长 春130041）

卵巢癌患者大多伴有大量腹水，目前其病理机制尚不完全清楚。水通道蛋白1（AQP1）是Agre最早发现的水通道，它分布广泛，具有特异转运水的功能，与多种疾病的发生和发展密切相关，目前已成为众多学者研究的热点［1］。AQP－1与卵巢肿瘤的关系国内外至今尚无报道。

1 资料与方法

1.1 试剂与方法

IMDM培养液，Hanks液，PBS、青霉素钠、硫酸链霉素、胎牛血清、均购自Sigma公司；AQP1原位杂交试剂盒、凋亡原位末端标记检测试剂盒，购自博士德生物技术公司。MTT购自鼎国生物试剂有限公司。人卵巢癌细胞株由大连医科大学馈赠。乙酰唑胺购自Sigma公司方法：将卵巢癌细胞体外培养，用96孔塑料板，每孔接种细胞悬液50μl；实验组加入乙酰唑胺50 μl使药物终浓度分别为1×10－8mol／L、5×10－8mol／L、10×10－8mol／L（各三孔）；对照孔不加药（三孔）；调零孔均加培养液（三孔）。以下按常规MTT法进行。

1.2 统计学分析 各组率的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 MTT结果

用MR700型酶标定量仪在试验波长570 nm，参考波长为450 nm下测定光密度值，按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率＝实验组OD值／对照组OD值×100%，结果见表1，图1。

表1 细胞存活率

图1 细胞存活率

三条曲线分别代表不同培养浓度的实验组，随着培养时间增长，各实验组细胞存活率均下降，1×10－8mol／L时细胞存活率总体趋势虽下降，但48 h时稍稍上升，考虑人为操作误差。5×10－8mol／L和10×10－8mol／L细胞存活率明显下降，10×10－8mol／L在48 h和72 h数值基本相同，考虑细胞存活率没有明显变化。

3 讨论

1988年Agre等在鉴别人类Rh血型抗原时偶然在红细胞膜上发现了1种新的跨膜蛋白［1］。1991－1992年Agre等又完成了该蛋白的分子克隆和功能鉴定，证明该蛋白具有水通道功能，从而确认了细胞膜上存在转运水的水通道蛋白的理论［2］。这种新的跨膜蛋白分子量为2.8×103，于1997年被正式命名为水通道蛋白1（AQP1）.随后，在许多动、植物及微生物中相继发现水通道蛋白。目前哺乳动物的组织中已经鉴定11种水通道白（AQP0－AQP10），广泛分布于各种组织和器官，在维持机体的水平衡中起着重要的作用，且与水平衡紊乱所造成的一些疾病密切相关，其中以AQP1分布最广，作用最多。

AQP1广泛分布于机体，特别是那些与液体吸收和分泌有关的上皮细胞及可能协同水跨膜转运的内皮细胞中，AQP1只允许水自由双向的穿过细胞膜，不转运离子，质子等［3］。研究发现：多种肿瘤组织亦表达AQP1，可能与肿瘤细胞的起源，生长、转移等密切相关［4，5］。此外，在微血管内皮细胞也发现AQP1的高度表达，推测AQP1的高表达也可能与肿瘤的血管新生有关［6－8］。

四唑盐是一种能接受氢离子的染料，化学名是3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴盐，商品名是噻唑蓝，简称为MTT。MTT法测定细胞存活率的机制是MTT在活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的作用下还原成难溶性蓝色的甲潜（formazan），而死亡细胞却不能，细胞存活越多，蓝色产物在酶标仪上检测的OD值就越大。本研究应用MTT法通过检测细胞存活率来间接检测细胞凋亡率，可以从另一个角度来检测乙酰唑胺对AQP1的抑制作用。结果显示：1×10－8mol／L组分别和5×10－8mol／L组、10×10－5mol／L组相比，差异均有显著性（P＜0.05）。5×10－8mol／L组和10×10－5mol／L组之间差异没有显著性（P＞0.05）。在24 h与72 h之间比较，差异有显著性（P＜0.05）。24 h与48 h之间，48 h与72 h之间差异没有显著性（P＞0.05）。证明乙酰唑胺对体外培养的卵巢癌细胞AQP1的抑制作用与时间、浓度有一定的关系但是具体的相关性还需进一步证明。实验组在药物浓度为1×10－8mol／L时，细胞存活率总体趋势是下降，但是48 h时有一个上升，考虑实验中有很多因素包括人为因素引起的误差，考虑该点的上升为实验的偶然性。实验组药物浓度为10×10－8mol／L时，随着培养时间增加，24 h与48 h之间细胞存活率有明显变化，但是48 h与72 h之间细胞存活率没有明显变化。实验组在药物浓度为5×10－8mol／L时，随培养时间的增加，细胞存活率明显下降，即细胞凋亡率明显上升，所以原位末端标记法和逆转录－聚合酶链反应方法均采用该浓度为实验组。

本实验证明了应用乙酰唑胺可以抑制体外培养的卵巢癌细胞的培养，推测应用AQP抑制剂可以抑制肿瘤生长、侵袭和转移，至少可能部分抑制肿瘤的生长、侵袭和转移，希望通过开发应用水通道蛋白抑制剂来治疗肿瘤。

［1］Denker BM，Smith BL，Kuhajda FP.Identification，purification，and partial characterization of a novel，M28000 membrane protein from erythrocytes and renal tubules［J］.J Biol Chem，1988，263（30）：15634.

［2］Reston G M Agre P.Isolation of the cDNA for erythrocyte integral membrane protein of 28 kilodaltons：member of an ancient channel family［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，1991，88（24）：11110.

［3］Verkman AS.Applications of aquaporinin hibitors［J］.Drug News Perspect，2003，14（7）：412.

［4］冯学超，麻彤辉.水通道蛋白的生理功能［J］.生物化学与生物物理进展，2005，21（4）：291.

［5］SaadounS，Papadopoulos MC，Hara－Chikuma M.Impairment of angiogenesis and cell migration by targeted aquaporin－1 gene disruption［J］.Nature，2005，525（7034）：786.

［6］Verkman AS.Aquaporin water channels and endothelial cell function［J］.J Anat，2002，144（6）：617.

［7］Polverini PJ.Angiogenesis in health and disease：insignts into basic mechanisms and therapeutic opportunites［J］.J Dent Educ，2002，66（8）：962.

［8］水通道蛋白亚型AQP－9在雄性小鼠生殖系统的表达［J］.吉林大学学报（医学版），2004，30（1）：52.

［9］石一复，郝 敏，丁志明.卵巢癌腹水的研究［J］.中华妇产科杂志，2000，35（9）：551.

［10］Yang B，Folkesson HG，Yang J，et al.Reduced osmotic water permeability of peritoneal barrier in aquaporin 1 knockout mice［J］.Am J Physiol，1999，276（1）：76.

［11］Akiba T，Ota T，Fushimi K，et al.Water channel AQP 1 in the primary cell culture of rat peritoneum［J］.Adv Perit Dial，1999，15：3.