响应面法优化硫酸软骨素提取的酶解工艺

陈 亚，徐晓燕

(江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室，江苏省盐城技师学院，江苏 盐城 224002)

响应面法优化硫酸软骨素提取的酶解工艺

陈 亚，徐晓燕

(江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室，江苏省盐城技师学院，江苏 盐城 224002)

目的 以猪喉软骨为原料，提取硫酸软骨素，优化酶解工艺条件。方法 采用碱提-酶解-醇沉的方法提取硫酸软骨素，在单因素试验的基础上，通过响应面分析优化酶解工艺。结果 酶解最佳工艺组合为:胰酶浓度1.0%、pH值8.6、酶解温度46℃、酶解时间2.8 h。结论 采用上述组合，以氨基葡萄糖含量为指标，氨基葡萄糖含量达25.94%。研究结果具有工业应用价值。

硫酸软骨素;提取;酶解;响应面法;猪喉软骨

硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)是具有硫酸基、羧基和乙酰基的一类糖胺聚糖［1］，广泛存在于动物软骨、骨、肌腱、肌膜和血管壁中，根据其硫酸基团位置和数量的不同，分为硫酸软骨素A、B、C、D、E等，其中最常见的是硫酸软骨素A(CSA)和硫酸软骨素C(CSC)。CS具有降血脂、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、调节免疫等多种药理活性［2-3］，我国生产的CS除满足国内需要外，年出口总量达到3 700吨，随着各国对CS产品质量标准的提高，国际上对高纯度CS的需求量逐年增加［4］。

目前国内主要以碱提-酶解-醇沉的方法制备CS［5-6］。由于CS在组织中以蛋白多糖的形式存在，其多糖链与核心蛋白通过共价键连接，该工艺中碱液提取的目的主要是破坏多糖链与蛋白质之间的共价键，使蛋白多糖的糖肽键断裂，从而将CS释放出来;而酶解环节则是为了进一步去除蛋白质等杂质，提高CS的纯度，因而从整个生产流程看，碱液提取和酶解这两步非常关键，它直接关系到CS的产率和质量。本文以猪喉软骨为原料，通过碱提-酶解-醇沉的方法制备CS，重点对酶解这一直接影响CS纯度的关键步骤开展优化研究，以期得到优化的生产工艺。

1材料

新鲜猪喉软骨，市售;胰酶(5 000 u/g)，上海蓝季科技发展有限公司;盐酸氨基葡萄糖，南通双林生物制品公司。

FA1604型电子天平，上海上天精密仪器有限公司;PHS-3C型实验室pH计，上海精密科学仪器有限公司;SF-200型万能粉碎机，泰州博精制药机械有限公司;722型可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司。

2方法

碱提-酶解-醇沉法制备CS的工艺流程为:原料预处理→碱液提取→酶解→去除杂质→沉淀干燥→CS粗品。工艺中的原料预处理、碱液提取、去除杂质、沉淀干燥等步骤参考文献［5-6］。本研究重点通过单因素试验和响应面分析的方法，对酶解环节进行优化研究。

2.1 单因素试验

对经碱液提取后的提取液，用2 mol/L HCl溶液调节pH值至8.0～9.0，加入胰酶进行酶解。根据影响酶促反应的因素，分别对胰酶水解过程中的胰酶浓度、酶解时间、酶解温度和pH值进行单因素试验，以确定单因素的最佳条件。

分别选取胰酶浓度 0.5%，0.7%，0.9%，1.1%，1.3% 和 1.5%，酶解时间为 2 h，酶解温度45℃，pH值8.5时，考察胰酶浓度对 CS纯度的影响。

当胰酶浓度0.9%，酶解时间分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 和 3.5 h，酶解温度 45 ℃，pH 值 8.5时，考察酶解时间对CS纯度的影响。

当胰酶浓度0.9%，酶解时间2 h，酶解温度分别为40，42，44，46，48 和 50 ℃，pH 值 8.5 时，考察酶解温度对CS纯度的影响。

当胰酶浓度0.9%，酶解时间2 h，酶解温度46 ℃，pH 值分别为 7.9，8.1，8.3，8.5，8.7 和 8.9时，考察pH值对CS纯度的影响。

2.2 响应面法分析

利用响应面法对酶解中影响CS纯度的因素及因素间的交互影响进行优化，即根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理［7-8］，综合单因素试验结果，选取胰酶浓度、pH值、酶解温度、酶解时间，进行四因素三水平试验，利用响应面法分析影响胰酶水解的主次因素，得出该阶段的最优工艺条件。

2.3 CS 纯度检测

根据《中华人民共和国卫生部药品标准》［9］，CS纯度以氨基葡萄糖含量为指标。采用Elson-Morgan法测定氨基葡萄糖含量［9-11］。

2.3.1 氨基葡萄糖标准曲线的制备 配制系列浓度的盐酸氨基葡萄糖标准液，加乙酰丙酮试液，沸水浴加热5 min，冷却后加无醛乙醇，60℃水浴加热5 min，加对二甲氨基苯甲醛试液，60℃水浴加热40 min，冷却，测定在525 nm波长处的吸光度(A)值。以盐酸氨基葡萄糖浓度(C)为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为:A=0.051 7 C+0.029 5，r=0.999 8。

2.3.2 样品测定 取样品约0.05 g，精密称定，加入3 mol/L HCl溶液5 mL，沸水浴加热60～80 min，冷却，滴加20%NaOH溶液调节pH值至7.0，加水至100 mL，过滤，取滤液按2.3.1项下方法操作，测定525 nm波长处的A值，根据标准曲线求出样品中的盐酸氨基葡萄糖含量，经换算得到样品的 CS含量。

3 结果与讨论

通过单因素试验，得到酶解中单因素的最佳条件:胰酶浓度为0.9%、酶解时间为3.0 h、酶解温度为46℃、pH值为8.5，相应的CS中氨基葡萄糖含量分别为 25.39%，25.63%，25.90%和 25.90%。

在单因素试验基础上，进行四因素三水平的响应面分析，确定酶解的最佳条件，试验设计方案与结果见表1～2。将获得的试验数据采用Design-Expert 7.0软件进行多元回归拟合，得到氨基葡萄糖含量对胰酶浓度(A)、pH值(B)、酶解温度(C)和酶解时间(D)的二次多项回归方程:氨基葡萄糖含量Y=25.90+0.10A+0.39B+0.10C －0.017D+0.16AB+0.27AC －0.17AD －0.018BC+0.10BD －0.062CD －0.45A2－1.43B2－1.44C2－0.15D2。

表1 响应面设计因素编码及水平Tab.1 Codes and levels of the response surfacemethodology

对该回归模型进行方差分析，并对模型系数进行显著性检验，结果见表3。由表3可知，模型P＜0.000 1，表明响应回归模型达到了极显著水平;失拟项 P=0.402 9＞0.05，不显著，说明该模型拟合程度良好，可用于对酶解进行分析和预测。此外，P值不但可用于检验模型系数的显著性，也可反映变量作用以及变量之间交互作用的大小，P值越小表示作用越显著［12］。由表3可知，pH值对氨基葡萄糖含量的线性效应显著(P＜0.05)，胰酶浓度、酶解温度、酶解时间对氨基葡萄糖含量的影响不显著;而胰酶浓度和酶解温度两者交互作用对氨基葡萄糖含量的影响较显著，胰酶浓度和pH值、胰酶浓度和酶解时间、pH值和酶解温度、pH值和酶解时间、酶解温度和酶解时间的交互作用对氨基葡萄糖含量的影响不显著。图1为胰酶浓度和酶解温度交互作用的响应面分析图及等高线图，由图2可知，在所设计的试验条件范围内，氨基葡萄糖含量随着胰酶浓度的增加和酶解温度的升高都是先提高后降低，响应面图呈钟罩型，说明胰酶浓度和酶解温度交互作用较显著，这与表3的结果一致(表3交互项中AC的P值最小)。

表2 响应面法分析方案与试验结果Tab.2 The experimental design and results of the response surfacemethodology

表3 回归模型的方差分析Tab.3 The variance analysis for the regression model established

图1 胰酶浓度和酶解温度对氨基葡萄糖含量影响的响应面图等高线图Fig.1 Three-dimensional response surface and contour plots showing the interactive effects of the enzyme concentration and the temperature on the content of glucosamine

通过软件Design-Expert 7.0求解回归方程，得到氨基葡萄糖含量预测值最大时的因素水平为:胰酶浓度0.97%、pH 值 8.57、酶解温度 46.22 ℃、酶解时间 2.80 h，氨基葡萄糖含量的预测值为25.97%。考虑到实际操作，将实验条件修正为胰酶浓度1.0%、pH 值8.6、酶解温度46℃、酶解时间2.8 h。在此条件下通过3次平行试验，测定实际氨基葡萄糖含量为25.94%，与预测值基本吻合，偏差较小，说明回归方程能较真实地反映各因素对氨基葡萄糖含量的影响，证明该模型用于优化CS提取过程中酶解工艺是可行的。

4结论

在单因素试验基础上，利用响应面法建立了从猪喉软骨提取CS过程中酶解的胰酶浓度、pH值、酶解温度、酶解时间与CS纯度(氨基葡萄糖含量)之间关系的二次多项回归模型，经验证该模型拟合程度高，准确有效。优化得到的最佳酶解工艺修正条件为胰酶浓度1.0%、pH值8.6、酶解温度46℃、酶解时间2.8 h。此时获得的CS，其实际氨基葡萄糖含量为25.94%，与预测值(25.97%)基本吻合，且高于《中华人民共和国卫生部药品标准》规定的猪软骨组织来源的CS中氨基葡萄糖含量不得少于24.0%的标准［9］。表明响应面法用于酶解工艺的优化是可靠的，本研究可为CS生产企业改进生产工艺，提高产品质量和经济效益提供理论和实验依据。

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Optim ization of enzymatic hydrolysis of chondroitin sulfate extraction by response surfacemethodology

CHEN Ya，XU Xiao-yan

(Jiangsu Key Laboratory of CoastalWetland Bioresources and Environmental Protection，Yancheng Technician College，Yancheng 224002，China)

Purpose The chondroitin sulfate was isolated from pig laryngeal cartilage.The technique of enzymatic hydrolysis of chondroitin sulfate extraction was improved.M ethods The chondroitin sulfate was isolated through the process of alkali extraction-enzymatic hydrolysis-alcohol precipitation。Based on the single factor tests，the technique of enzymatic hydrolysis of chondroitin sulfate extraction was improved by response surfacemethodology.Results To extract the chondroitin sulfate from pig laryngeal cartilage in enzymatic hydrolysis，the best combination of extracting technique was:the enzyme concentration of 1.0%，8.6 of pH，the temperature of 46 ℃，and the time of 2.8 h.Conclusion The content of glucosamine in the chondroitin sulfate was 25.94%after the optimization of the technique.The results can be calculated for industrial use.

chondroitin sulfate;extraction;enzymatic hydrolysis;response surface methodology;pig laryngeal cartilage

R282.74;TQ464.1

:A

:1005-1678(2012)05-0548-04

2012-04-26

江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室开放课题项目(JLCBE11006)

陈 亚，女，硕士，高级讲师，主要从事生物医药、生物化工方面的研究，E-mail:ycjsxycy@sina.com。