不同提取方法的野马追提取物抗氧化作用的比较研究

李姿瑾，纪丽莲

(1.扬州大学，江苏扬州225127;2.淮阴师范学院，江苏淮安223300)

不同提取方法的野马追提取物抗氧化作用的比较研究

李姿瑾1，2，纪丽莲2

(1.扬州大学，江苏扬州225127;2.淮阴师范学院，江苏淮安223300)

以野马追干制品为原料，利用6种不同的提取方法得到粗提物，分别利用FRAP法、ABTS法、超氧阴离子自由基清除法、总还原力法、羟自由基清除法、抗脂质体过氧化法对抗氧化活性进行测定比较，其中以BHT和BHA为阳性对照。除抗脂质体过氧化活性以外，6种提取方法得到的粗提物均表现出较强的抗氧化活性，但不同方法粗提物的具体抗氧化活性指标差异显著。水煎物清除羟自由基的作用最明显，清除率为96.97%(P＜0.05)。70%乙醇回流法提取物对超氧阴离子自由基的清除作用最明显，清除率高达87.70%(P＜0.05)。渣提物的总还原能力最强(P＜0.05)。六种提取物都具有高于BHT和BHA的ABTS+·清除能力，其中70%乙醇回流法和浸提法粗提物无显著性差异。

野马追，抗氧化，提取物

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

RE－3000型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;SHZ－D型循环式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;WH－3微型漩涡混合仪 上海沪西分析仪器有限公司;UV757CRT型紫外可见分光光度计上海精科;电子天平 赛多利斯(北京)有限公司; DHG－9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;HH－8型数显恒温水浴锅 江苏金坛市亿通电子有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 野马追提取物的制备 Ⅰ:称取野马追干品150g，分三次加入70%乙醇，70℃恒温回流，每次2h，提取液浓缩干燥后备用。Ⅱ:称取野马追干品130g，分三次加入甲醇，60℃恒温回流，每次2h，提取液浓缩干燥后备用。Ⅲ:称取野马追干品750g，分三次加入90%乙醇浸提，每次90%乙醇体积约为3500mL，每次室温下浸提48h，提取液减压抽滤后旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥处理后备用。Ⅳ:称取野马追干品750g，分三次加入70%乙醇浸提，每次室温下浸提48h，提取液减压抽滤后旋转蒸发浓缩，干燥处理后备用。Ⅴ:称取野马追干品350g，分三次加水煎煮，提取液过滤浓缩后，冻干备用。Ⅵ:90%乙醇浸提后的滤渣烘干后称取350g分三次加水煎煮，水煎液过滤浓缩后，冻干备用。

其中:Ⅰ代表70%乙醇回流法提取物，Ⅱ代表甲醇提取物，Ⅲ代表90%乙醇提取物，Ⅳ代表70%乙醇浸提物，Ⅴ代表水煎物，Ⅵ代表渣提物。

1.2.2 提取物抗氧化实验

1.2.2.1 清除羟自由基能力的测定 采用Fenton［10］法进行，通过测定水杨酸捕获·OH所得到的产物确定野马追提取液对·OH的清除率。待测样品重复测定三次，取三次平行实验的平均值(以下每种测定方法均测定三次待测样品，取均值)，同时扣除底物野马追对吸光值的影响。

式中:A0为空白管的吸光值，A为样品管的吸光值，A底为野马追本身的吸光值。

1.2.2.2 ABTS法 根据 Re［11］等的方法，向2.9mL ABTS试剂中加入0.1mL不同提取法提取的5mg/mL的样品液，室温放置10min，在734nm下测定吸光值A。同时测定2.9mL ABTS试剂与0.1mL吐温－80混合液的吸光值A0。

ABTS试剂的配制:用蒸馏水配制14mmol/L的ABTS溶液，用蒸馏水配制4.9mmol/L的高硫酸钾溶液，分别将ABTS和高硫酸钾溶液按1∶1体积比混合过夜，临用前用乙醇稀释混合液，稀释终点用混合液的吸光值来判断，当吸光值为 A734nm为 0.700± 0.020［12］时即可。

胡适认为生命的意义“在于自己怎样生活”，若能坚定地“用此生作点有意义的事”，“活一日便有一日的意义，作一事便添一事的意义，生命无穷，生命的意义也无穷了”[注]胡适：《人生有何意义》，胡适著、欧阳哲生编：《胡适文集》第4册，北京：北京大学出版社，2013年，第571页。 。时间造就生命。他呼吁“无量平常人”要积极参与历史进程，倡导“健全的个人主义”，即作为生命个体存在的“我”不仅要做“进化”洪流中图存的“适者”，更要负责任地创造无穷时空中的“不朽”；不仅要有时间急迫感，追求“经济”的时间，更要自主地驾驭“闲暇”时间，充分发展自我，实现个性。胡适对“个人”的大力弘扬，也标志着个体时间意识的觉醒。

1.2.2.3 清除超氧阴离子自由基［13］采用Marklund法，利用邻苯三酚自氧化体系测定野马追提取物对超氧阴离子自由基的清除作用。

具体方法为:Tris－HCl缓冲液(pH 8.2，0.05mol/L)置于25℃水浴中预热20min，在10mL离心管中分别加入4.5mL Tris－HCl缓冲溶液，加入0.1mL样品、0.4mL邻苯三酚溶液(2.5mmol/L)，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1mL HCl(0.8mmol/L)终止反应，于299nm处测定吸光度A，空白对照组以相同体积吐温－80溶液代替样品。

1.2.2.4 还原能力［14］实验原理:当体系中存在还原性物质时，铁氰化钾被还原成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾在酸性条件下与三氯化铁反应，生成普鲁士蓝，在波长700nm处有最大吸收峰。故吸光度值越大，则提取液的还原能力越强［15］。

分别将1mL各提取液与2.5mL磷酸缓冲溶液(0.2mol/L，pH6.6)混合，再加入1%铁氰化钾2.5mL混合物于50℃恒温20min后用流水迅速冷却，再加1mL 10%三氯乙酸，然后3000r/min离心分离10min取上层清液2.5mL加入蒸馏水2.5mL和0.1%FeCl30.5mL混合均匀反应10min在700nm处测定吸光度，吸光度越高，说明这种反应混合物的还原性越强。

1.2.2.5 脂质体抗氧化活性的测定［16］脂质体的制备:脂质体PBS分散系(LLS)900mg卵磷脂溶解于90mL、50mmol/L、pH7.4的PBS中，冰水浴超声2h。

于离心管中加入1.5mL的LLS，分别加入不同提取液300μL、1mmol/L的FeCl3600μL、1mmol/L抗坏血酸 600μL，在 37℃水浴 1h后加入 1.5mL TCA (20%)、1.5mL TBA(1%)沸水浴15min，在532nm测吸光值。

抑制率IC(%)=［A0－(A－A底)］/A0×100% 1.2.3 统计学分析 所有的数据都经过SPSS 16.0软件进行统计分析，LSD(P＜0.05)法进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 野马追对羟自由基的清除作用

从图1可知，野马追70%乙醇浸提物、水煎物、渣提物均有清除羟自由基的能力，其清除率分别为33.84%、96.97%、54.93%，大于阳性对照 BHT和BHA的23.82%，其中水煎法的野马追提取物清除羟自由基的能力最强，统计学分析表明其清除率与其他提取方法有显著性差异(P＜0.05)。

图1 野马追不同提取方法提取物对羟自由基的清除作用Fig.1 Different extraction methods of Eupatorium lindleyanum DC.extract on scavenging·OH

2.2 野马追对ABTS+自由基的清除作用

由图2可得，各种野马追的提取物均有清除ABTS+·的作用，并且自由基的清除率都在60%以上，但不同的提取方法之间其清除作用有差异，70%乙醇回流法提取物(99.2%)＞70%乙醇浸提物(98.29%)＞水煎物(93.41%)＞渣提物(91.40%)＞90%乙醇提取物(82.71%)＞甲醇提取物(66.20%)＞BHA(1.43%)＞BHT(1.15%)，其中，70%乙醇回流法提取物对ABTS+·的清除作用最强。70%乙醇回流法和70%乙醇浸提法无显著性差异，水煎法和渣提法得到的提取物对ABTS+·的清除作用也无统计学差异。

图2 野马追不同提取方法提取物对ABTS+·的清除作用Fig.2 Different methods of Eupatorium lindleyanum DC.extract on scavenging ABTS+·

2.3 野马追对超氧阴离子自由基的清除作用

从图3可得，70%乙醇回流法提取物对超氧阴离子自由基的清除作用最明显，清除率高达87.70%，且与其他提取方法所得的提取物有显著差异(P＜0.05)。甲醇提取物、90%乙醇提取物、70%乙醇浸提物、水煎物、渣提物的清除率分别为13.39%、54.39%、10.54%、13.47%、5.77%，统计分析可知:甲醇提取物、70%乙醇浸提物和水煎物对超养阴离子的清除作用无统计学差异，而BHT和BHA的清除率分别为24.20%和6.78%。

图3 野马追不同提取方法提取物对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.3 Different methods of Eupatorium lindleyanum DC. extract on scavenging O2－·

2.4 野马追总还原力测定

当铁氰化钾被野马追还原成亚铁氰化钾，在酸性条件下与三氯化铁反应，生成普鲁士蓝，波长700nm处有最大吸收峰，故吸光值越大，野马追提取液的还原能力越强。由图4得，各提取物还原力由强到弱的顺序是渣提物(1.92)＞70%乙醇回流法提取物(1.07)＞70%乙醇浸提物(1.00)＞90%乙醇提取物(0.98)＞甲醇提取物(0.83)＞水煎物(0.70)，各种提取物的还原力均优于BHT(0.02)和BHA (0.03)。渣提物的总还原力显著高于其他提取物，有统计学意义(P＜0.05)。

图4 野马追不同提取方法提取物总还原力测定Fig.4 Different extraction methods of Eupatorium lindleyanum DC.extract for determination of total reducing

2.5 野马追抗脂质过氧化能力的测定

由图5知，野马追70%乙醇回流法提取物、甲醇提取物、90%乙醇提取物、70%乙醇浸提物均对脂质过氧化反应有抑制作用，其抑制率分别为23.14%、26.26%、23.62%和 8.00%，其抑制作用低于 BHT (61.09%)和BHA(49.32%)。

图5 野马追不同提取方法提取物抗脂质过氧化能力的测定Fig.5 Different extraction methods of Eupatorium lindleyanum DC. extract determination of lipid peroxidation capacity

3 结论

本实验对不同提取方法的野马追提取物进行了抗氧化活性的研究，以羟基自由基清除率、ABTS法、超氧阴离子自由基清除率、总还原能力法、脂质体抗氧化活性的测定模型测定了各提取物的抗氧化能力，见表1。

结果表明:野马追的70%乙醇浸提物、水煎物和渣提物均有清除羟自由基的能力，清除率明显强于BHT和BHA，其中水煎物的清除作用最为明显，清除率高达96.97%，显著高于其他提取物(P＜0.05)。六种提取物都具有较强清除ABTS+·的能力，清除率明显高于BHT和BHA，70%乙醇回流法提取物清除率达99.2%，70%乙醇浸提物清除率为98.29%，二者无显著性差异。野马追70%乙醇回流法提取物清除超氧阴离子自由基的能力强于其余五种提取物和BHT、BHA，具有统计学意义(P＜0.05)。不同提取物总还原力由强到弱的顺序是:渣提物＞70%乙醇回流法提取物＞70%乙醇浸提物＞90%乙醇提取物＞甲醇提取物＞水煎物，渣提物的总还原能力显著高于其他几种提取物，差异具有统计学意义(P＜0.05)。野马追的各提取物抗脂质体过氧化的作用都不明显。

表1 不同提取方法提取物的抗氧化能力Table 1 Effect of different extracting methods antioxidant capacity

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Comparative study on the antioxidant activity of different kind of extracts from Eupatorium lindleyanum DC.

LI Zi－jin1，2，JI Li－lian2
(1.Yangzhou Univerity，Yangzhou 225127，China;2.Huaiyin Normal Univerity，Huaian 223300，China)

Extracts obtained by six different extraction methods from Eupatorium lindleyanum DC.were detected the antioxidant activity by the FRAP method，ABTS method，superoxide anion radical scavenging method，the total reducing power method，hydroxyl free radical scavenging method and antilipid peroxidation method，and the antioxidants BHT and BHA were used as positive controls.The results showed that，except the antilipid peroxidation activity，other activities of the extracts were of high－performance specific with its different methods.The clearance rate of the water decoction extract for hydroxyl radical scavenging activity was 96.97%，which was significantly higher than other extractions(P＜0.05).The superoxide anion scavenging effect of the 70%alcohol reflux extract was obviously stronger than other extractions，which the scavenging rate was 87.70%，and the difference with other extracts had statistical significance(P＜0.05).The reducing ability of the residue water extract was the strongest (P＜0.05)in the six extracts.All the six extracts had a strong ability to remove ABTS+·，which the clearance rates were higher than BHT and BHA，there was no significant difference in the clearance rate between the 70%alcohol reflux extract and the 70%ethanol extract.

Eupatorium lindleyanum DC.;antioxidant;extract

TS201.1

A

1002－0306(2012)08－0164－04

野马追(Eupatorium lindleyanum DC.)是菊科植物轮叶泽兰的全草，中医药理认为本品苦、平，具有清热解毒、祛痰、定喘、降血压和提高人体免疫力等功效，主要用于治疗慢性气管炎、支气管炎、高血压等疾病［1－2］。目前，野马追的活性研究主要集中在降血脂、降胆固醇［3－5］、止咳、平喘、化痰［6］、急性肺损伤等方面［7－9］，对于抗氧化作用的研究鲜有报道。近年来随着食品安全问题的不断出现，崇尚自然、健康食品的理念已越来越被大众所接受，所以开发天然高效、安全无毒、性能稳定的天然防腐剂成为食品工业研究的热点。现在用得最广泛的叔丁基羟基茴香醚(BHA)、二叔丁基羟基甲酚(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、特丁基对苯二酚(TBHQ)、三羟基苯丁酮(THBP)等，都因存在安全问题或性能上的缺陷而在使用上受到限制，所以研究野马追的抗氧化活性，可以为开发天然、高效、安全的食品防腐剂提供依据。

2011－07－08

李姿瑾(1986－)，女，硕士研究生，研究方向:营养生化方向。