发酵产云芝胞外多糖的分析及其在卷烟中的应用

王吉中，耿卢婧，席攀攀，许春平

(郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002)

发酵产云芝胞外多糖的分析及其在卷烟中的应用

王吉中，耿卢婧，席攀攀，许春平*

(郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002)

对发酵产云芝胞外多糖进行提取和脱蛋白处理得到精制云芝胞外多糖，之后过Sepharose CL－6B凝胶柱得到一个多糖组分，然后用红外光谱技术对该多糖组分的结构进行表征得知其为酸性多糖;将精制云芝胞外多糖以不同的浓度注入卷烟中，利用吸烟机捕集烟气粒相物计算出云芝胞外多糖在烟气中的转移率在2.76%～4.78%之间变动;用单料烟丝进行加香评吸实验，结果表明在精制胞外多糖添加量为0.04%时明显地改善了卷烟的吸食品质，起到掩盖杂气，去除刺激，改善余味的作用，使香气细腻程度有所提升。这为发酵产云芝胞外多糖在卷烟中的应用提供了一定的理论支持。

云芝，胞外多糖，转移率，感官评价

1 材料与方法

1.1 材料与设备

云芝菌株 为本实验室保藏;精制胞外多糖储备液 10mg/mL，溶剂为蒸馏水;散花成品烟 重量0.83g，烟支吸阻1050Pa，烟支规格84mm×24.5mm，滤嘴长30mm;单料烟丝 云南宣威HC1F。

Bruker TENSOR27红外光谱仪 德国FT－IR; CXG－1电脑恒温层析柜 上海青浦泸西仪器厂; Waters2487紫外检测器 美国water;UV1700PC紫外可见分光光度计 中国Phenix;METTLER 4E200电子分析天平 上海沛欧分析仪器有限公司; RE－52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂; LM5+吸烟机 德国Borgwaldt。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵产云芝胞外多糖组分分析 云芝发酵结束后，通过真空抽滤法分离菌丝与发酵液，用醇提法从发酵液中提取得胞外粗多糖［14］，然后用Sevag法脱蛋白［15］，经真空冷冻干燥得精制胞外多糖。称取80mg云芝精制胞外多糖溶于4mL 0.2mol/L的NaCl缓冲液，离心，上清液过0.45μm滤膜;取2mL上Sepharose CL－6B凝胶柱，以0.2mol/L NaCl缓冲液洗脱，流速为 0.6mL/min，利用分步收集器收集，5mL/管;用硫酸－苯酚法对胞外多糖进行检测。分离出的胞外多糖组分用旋转蒸发仪浓缩至10mL，透析(透析袋分子量8000～14000u)除去NaCl，真空冷冻干燥保存。

1.2.2 云芝胞外多糖组分红外光谱分析(IR) 称取过柱得云芝胞外多糖组分1mg，用溴化钾(KBr)压片后进行红外光谱(IR)分析。

1.2.3 精制云芝胞外多糖在烟气中转移率的测定

取不同体积精制胞外多糖储备液并加蒸馏水补充到0.5mL;注射进散花成品烟中，使烟支中胞外多糖含量分别达到烟支质量的 0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%，并做注射0.5mL蒸馏水的空白对照，每组10支;放入恒温恒湿箱(温度22℃，湿度60%)平衡48h;然后用吸烟机对烟支进行抽吸;将抽吸后的剑桥滤片放入150mL三角瓶中，加入50mL无水乙醇超声1h，倒掉乙醇，然后加入50mL无水乙醇超声0.5h，倒掉乙醇，再加入50mL蒸馏水超声两次，每次1h，合并滤液，用硫酸－苯酚法测定多糖含量，计算其在烟气中转移率。

1.2.4 精制云芝胞外多糖在卷烟中的感官评价 称取云南宣威HC1F单料烟丝4份，10g/份;之后取不同体积精制胞外多糖储备液并加蒸馏水补充到0.5mL，用微型喷雾器均匀喷洒在各组烟丝中，使胞外多糖含量分别达到烟丝质量的0.0%、0.01%、0.04%、0.08%，按照每支0.83g的标准制备卷烟;然后放入恒温恒湿箱(温度22℃，湿度60%)平衡48h。待平衡好后请郑州轻工业学院食品与生物学院的卷烟感官评吸小组进行评吸，从卷烟的香气质、香气量、浓度、细腻、杂气、刺激、余味等方面筛选出感官质量较好的样品［7］，确定云芝胞外多糖在卷烟中的添加量及其应用效果。

2 结果与讨论

2.1 发酵产云芝胞外多糖组分分析

将精制云芝胞外多糖样品过Sepharose CL－6B柱，用硫酸－苯酚法测定多糖含量，以管号为横坐标以多糖吸光度为纵坐标用SigmaPlot软件作图，结果如图1所示。

从图1可以看出，精制云芝胞外多糖经过Sepharose CL－6B柱分离出一种主要多糖组分。重复过柱5次，每次都对过柱后的溶液进行检测，检测结果相同，将5次所得到的组分收集起来进行浓缩、透析、冷冻干燥得到一个多糖组分。

图1 精制云芝胞外多糖过Sepharose CL－6B层析柱结果Fig.1 Elution profile of EPS of C.versicolor in Sepharose CL－6B chromatography.

2.2 过柱得云芝胞外多糖组分红外光谱分析

对过柱得云芝胞外多糖组分进行红外光谱监测得红外光谱图，结果见图2。

图2 过柱得云芝胞外多糖组分的红外光谱图Fig.2 The FT－IR spectra of the purified EPS fraction of C.versicolor

从图谱中特征吸收波峰分析可知，在3421.4cm－1有一特征宽峰，属O－H的伸缩振动，表明在该糖中应存在O－H;在2926.1cm－1处有吸收峰，应为C－H伸缩振动，是糖类的特征吸收峰，在2361、2335.8cm－1处有吸收峰，应为C=N或C=C伸缩振动，发生费米共振;在1645.7、1071.9cm－1处有吸收峰，说明该组分中有羧酸存在，推知该胞外多糖组分为酸性多糖。

2.3 精制云芝胞外多糖在烟气中转移率的测定

将精制云芝胞外多糖溶液以不同的浓度注入卷烟中，经吸烟机抽吸后，利用硫酸苯酚法测定卷烟烟气中的多糖含量，并扣除空白对照卷烟烟气中多糖含量，计算精制云芝胞外多糖在烟气中的转移率［16－17］，结果见图3。

由图3可知，精制云芝胞外多糖在烟气中的转移率随其在卷烟中浓度的增加出现了先增加后减少的变化趋势，在多糖添加量为0.02%时，转移率为2.76%，在多糖添加量为0.06%时，转移率为4.78%，而多糖添加量超过0.06%达到0.1%时，多糖在烟气中的转移率为3.82%。

2.4 精制云芝胞外多糖在卷烟中的感官评价

精制云芝胞外多糖在卷烟中的加香实验评吸结果见表1。结果表明:在添加浓度为0.04%时，精制云芝胞外多糖在卷烟中能有效地起到掩盖杂气，去除刺激，改善余味的作用，使香气细腻程度有所提升，烟气状态、圆润感较好，香气的协调性好，具有明显的中草药特征香，有助于提高卷烟的吸食品质。

表1 精制云芝胞外多糖在卷烟中的感官评价Table 1 The sensory evaluation of the purified EPS fraction of C.versicolor in the cigarette

图3 精制云芝胞外多糖在卷烟烟气中的转移率Fig.3 The transfer rate of the purified EPS fraction of C.versicolor in the cigarette smoke

3 结论

云芝发酵液经醇提、Sevag法脱蛋白质并经Sepharose CL－6B凝胶柱分离得到一个多糖组分，通过红外光谱分析得出该糖为酸性多糖;转移率测定的结果表明云芝胞外多糖在烟气中具有较好的转移率，为云芝胞外多糖可在卷烟当中的添加提供了理论支持，同时加香实验证明了发酵产云芝胞外多糖可起到烘托香气风格的作用，改善了卷烟的吸食品质，为云芝胞外多糖在卷烟中的添加提供了可行性证据。总之，该研究结果为云芝胞外多糖及其他药用真菌在卷烟等相关食品行业中的应用提供了一定的理论和技术支撑。

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Analysis of exopolysaccharides from fermented Coriolus versicolor and its application on tobacco flavour

WANG Ji－zhong，GENG Lu－jing，XI Pan－pan，XU Chun－ping*(College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China)

Exopolysaccharides(EPS)were extracted by ethanol from fermented fungi Coriolus versicolor，and purified by gel filtration chromatography on Sepharose CL－6B.The preliminary characterization of EPS was elucidated by IR，and EPS was an acidic carbohydrate.Different concentrations of EPS from Coriolus versicolor were injected in cigarettes，and calculated the transfer rates.It was showed that the transfer rate of EPS in gas was in the rage of 2.76%～4.78%and the adding 0.04%EPS could improve the quality，cover the smoking foreign gas，remove stimulus，and improve aroma aftertaste，fruity feeling and coordination.The results provided a strong support for the application of EPS in cigarette industry.

Coriolus versicolor;exopolysaccharide;transfer rate;sensory evaluation

TS201.2+3

A

1002－0306(2012)08－0140－03

云芝(Coriolus versicolor)又称为彩绒革盖菌，是常见且应用最为广泛的中草药之一。云芝中含有云芝糖肽、云芝多糖等多种有效药用成分，其中云芝多糖是国际公认的高效免疫促进剂［1－2］。据报道，云芝多糖是一种口服有效的多糖［3］，临床可用于治疗慢性乙型肝炎、酒精肝，加强消化系统、肺及宫颈、乳腺等部位的癌症放化疗作用，可明显提高患者的细胞免疫功能和体液免疫功能，增强机体对化学治疗的耐受性，减少感染与出血，提高患者生命质量［4－6］。还有研究表明，含有云芝等类中草药有效成分的卷烟在燃吸时，其有效成分被蒸馏、气化、挥发和升华形成微粒相和气相，可捕获烟气中的自由基，阻断或降低有害物质的生成，减轻吸烟引起的心血管和微循环系统的危害［7－10］。因此，烟用中草药的研究目前已成为各烟草企业和科研院所研究的热点之一［11－13］，但目前，还未见发酵产云芝胞外多糖用于卷烟中的相关报道。实验对发酵产云芝胞外多糖进行了提取分离和结构分析，并对其在卷烟中的应用效果进行初步研究，为进一步研究中草药在卷烟中的应用提供理论基础。

2011－04－13 *通讯联系人

王吉中(1975－)，男，硕士，讲师，研究方向:生物技术。

郑州市科技计划(10PTGG339，112PPTGY249);郑州轻工业学院校博士基金(20100426)。