Protex 6L直接酶解红豆粉提取红豆肽的研究

刘 琪，江连洲，2，*，李 扬，2，王 梅，王胜男，齐宝坤

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.国家大豆工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨150030）

Protex 6L直接酶解红豆粉提取红豆肽的研究

刘 琪1，江连洲1，2，*，李 扬1，2，王 梅1，王胜男1，齐宝坤1

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.国家大豆工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨150030）

采用Protex 6L直接酶解红豆粉的方法提取红豆肽，通过响应曲面分析得出Protex 6L蛋白酶提取红豆蛋白的最佳条件：pH为9.4，加酶量为3.14%，温度为60℃，时间为3.5h，料液比为1∶6.9（g/mL）。并采用凝胶层析过滤色谱分析了不同水解时间水解物分子量的变化，发现红豆蛋白中存在一些不容易被Protex 6L酶解的成分，红豆粉的Protex 6L酶解过程是一个不均匀的过程。

Protex 6L，酶解，红豆肽，响应面法

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红豆 市售，粉碎后过80目筛，蛋白质20.7%、灰分3.3%、脂肪0.5%、碳水化合物58%、水分4.8%；Protex 6L（活力1.0×105U/mL） 丹麦Novo公司；Sephadex G-75 Fine Amersham Pharmacia Biotech公司；Bacitracin、Enkephalin、Angiotensin Sigma公司；牛血清白蛋白 海伯奥生物科技有限公司。

Z12-S9粉碎机 上海精科实业有限公司；LD4-2A离心机 北京医用离心机厂；JJ-1精密电动搅拌机 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；ALC310.3电子分析天平 北京赛多利仪器有限公司；pHS-25型酸度计 上海伟业仪器厂；DZKW-8-4电热恒温水浴锅 余姚市东方电工仪器厂；HYP消化炉、KDN-04B半自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验流程 红豆→除杂→研磨→水分调节→粉碎60目过筛→调节温度和pH→加酶水解→灭菌→离心分离→上清液加入等体积TCA→离心分离→上清液定氮

1.2.2 红豆肽的酶解工艺[9]采用单因素实验对加酶量、酶解温度、酶解时间、料液比和酶解pH5个因素进行研究，确定各因素的最佳水平值范围，再采用响应面中心组合实验设计，研究各酶解参数对考察指标的影响规律。选取加酶量、酶解温度、酶解时间、料液比和酶解pH5个因素为自变量，以多肽得率为响应值，优化红豆肽提取工艺的最佳参数。

1.2.3 多肽得率测定方法

式中：N1-在10%TCA中可溶性氮，mg；N2-原料红豆中总氮，mg。

1.2.4 色谱条件 色谱柱：Sephadex G-75 Fine凝胶柱；柱温：室温（约25℃）；流速：0.5mL/min；进样量：2%的红豆蛋白和肽混合液为2mL，流动相：70%；检测器：waters486紫外检测器；色谱仪：waters 650蛋白质纯化系统，检测波长为280nm。

2 结果与分析

2.1 Protex 6L水解条件对红豆肽得率的影响

2.1.1 加酶量对多肽得率的影响 由图1可知，在一定范围内，随着加酶量的增加，多肽得率升高，当加酶量到达2%时，多肽得率接近最大值，但超过2%时，多肽得率趋于稳定。原因主要为酶量增加，酶与底物作用得越充分，蛋白酶对蛋白质的分解作用越大，从而有利于多肽的产生。因此，最佳的加酶量为2%。

图1 加酶量对多肽得率的影响Fig.1 Effect of enzyme additive amount of hydrolysis on polypeptides recovery

2.1.2 酶解温度对多肽得率的影响 如图2所示，在低于60℃时，多肽得率随着温度的升高而增加，当温度高于60℃时，多肽得率随着温度的升高而降低，因为此后温度将超过酶的最适温度，酶活性降低，高温会使碱性蛋白酶变性，部分或全部失去催化活性[10]，因此最适温度为60~65℃。

图2 温度对多肽得率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis temperature of hydrolysis on polypeptides recovery

2.1.3 酶解时间对多肽得率的影响 如图3所示，当时间低于3.5h时，多肽得率大幅上升，变化程度较明显，随着时间的延长，多肽得率变化程度不明显。说明随着时间的延长，底物不断减少，酶解充分。因此最适合的酶解时间为3.5~4h。

图3 酶解时间对多肽得率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time of hydrolysis on polypeptides recovery

2.1.4 料液比对多肽得率的影响 如图4可知，随着料液比的降低或底物浓度的升高，蛋白得率先升高而后缓慢下降，在1∶7时最高。酶法提取红豆肽的过程中适量的水对酶解具有积极的意义，但水过量时，酶反应体系中酶浓度和底物浓度低，使酶分子与底物分子碰撞的几率降低，酶作用效果降低；水量过低，则料液黏度太大，影响了酶和底物的流动，也降低了酶作用效果[11]。因此在响应面实验设计中料液比选择1∶6～1∶8。

图4 料液比对多肽得率的影响Fig.4 Effect of solid to liquid of hydrolysis on polypeptides recovery

2.1.5 pH对多肽得率的影响 如图5可知，随着pH的增加，多肽得率逐渐增加，当pH为8~9时，多肽得率最高，而后随着pH的增加，多肽得率逐渐降低。主要的原因是实验用碱性蛋白酶的最适pH接近9，pH在9附近时，酶活高，酶对底物作用的效果明显，多肽提取率高；反之，多肽得率低[12]。因此最适的pH为9。

图5 酶解pH对多肽得率的影响Fig.5 Effect of materials to pH water rate of hydrolysis on polypeptides recovery

2.2 Protex 6L酶解工艺条件的响应面实验结果

2.2.1 实验设计的因素与水平 以酶解温度、酶解时间、料液比、pH、加酶量为自变量，以单因素实验所得红豆多肽得率为响应值（y），采用响应面分析法在五因素五水平上对酶解过程进行优化，以达到最大限度提取红豆多肽的目的。实验设计及结果见表1和表2。

表1 响应面优化实验因素水平编码表Table 1 Encode table of factors and levels

2.2.2 回归模型的建立和方差分析 采用SAS软件对响应值与各因素进行回归拟合后，得到回归方程[13]：

y=81.154+6.35x1+3.66x2-2.32x4-4.59x12+2.29x1x2+ 5.82x1x4-9.16x22+12.57x2x3+1.07x2x5-5.07x32-11.43x42+ 0.073x4x5-1.74x52

表3和表4可看出，该回归方程的一次项和二次项非常显著，说明各个实验因素对响应值的影响是二次抛物线的关系。整体模型的“Pr＞F”值小于0.05，表明该二次方程模型比较显著；R2=0.9818，说明这种实验方法是可靠的，能够很好地描述实验结果，使用该方程进行真实的实验点分析是可行的。回归系数显著性检验表明，在所选取的各因素水平范围内，对Protest 6L酶解红豆粉影响的排序依次为：酶解pH＞加酶量＞酶解时间＞酶解温度＞料液比。

2.2.3 响应因子水平的优化 由图2的响应面可看出x1、x2、x3、x4、x5存在极值点，对y进行岭脊分析[14]，分析可知，5个因素的最优实验点（x1、x2、x3、x4、x5）代码值（0.87597、0.27994、-0.03184、0.11656、-0.14947）即（9.4380、3.1400、59.8408、3.5291、6.9253），根据实验的实际情况，5个因素的最优取值为9.4、3.14、60、3.5、料液比为1∶6.9，此时y取最大值84.29%。也可用拟合的二次方程分别对x1、x2、x3、x4、x5求偏导，得出方程组，然后解方程组，分别求出x1、x2、x3、x4、x5和y。此方法比较繁琐且得出的结果可能是响应面的鞍点，并不一定是极值点。在以上优化的稳定点进行3次验证实验，证明预测值84.51%与实验平均值84.29%是非常接近的。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Experiment design and results

表3 回归方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

表4 回归系数取值及分析结果Table 4 Value of regression coefficient and analysis results

图6 各酶解参数交互显著项对多肽得率的响应面分析Fig.6 Response surface analysis of significant effective interaction items of different hydrolysis parameters on polypeptides recovery

2.3 红豆粉水解过程中分子量变化与红豆肽释放关系探讨

通过以上研究发现，水酶法提取红豆肽过程中，蛋白质的水解状态对红豆肽的影响很大。将已知分子量的标准品[a牛血清白蛋白（分子量65982u）、b卵白蛋白（分子量43988u）、c胰蛋白酶（分子量20994u）、d溶菌酶（分子量13996u）和e胰岛素（分子量5499u）]分别称取20mg溶解于3mL pH为8的磷酸盐缓冲溶液中。将5种配制好的蛋白质标准品溶液混合振荡均匀后，抽取混合液1mL加样到SephadexG-75，在280nm分别检测蛋白质吸光值。根据标准品分子量对数与保留时间关系建立线性方程[15]（见图7）。

采用最小二乘法求出直线的回归方程为：y= -0.0821x+6.4726，R2=0.9883，式中：x代表保留时间，y代表分子量对数。采用该回归方程可以根据某蛋白的保留时间估算出该物质的分子量。

图7 分子量对数与保留时间的关系Fig.7 Logarithm of molecular weight as a function of elution time

在最佳酶解工艺条件（pH为9.4，加酶量为3.14%，温度为60℃，时间为3.5h，料液比为1∶6.9）下，按照不同水解时间取样品喷雾干燥。分别称取喷雾干燥后粉末20mg溶解于3mL pH为8的磷酸盐缓冲溶液中。将待测样品混合振荡均匀后，抽取1mL经0.22μm微滤膜过滤后，加样到SephadexG-75检测蛋白质吸光值（见图8）。

图8 红豆的Protex 6L酶水解产物SephadexG-75凝胶洗脱图谱Fig.8 SephadexG-75 gel elution spectrum of red bean hydrolysate by Protex 6L

由图8可以看出洗脱谱图的排阻时间位置，根据图7分子量对数与保留时间关系的线性方程换算出各峰的分子量分布发现，先出现的峰为分子量大于100000u的蛋白质，后出现的一系列峰为分子量小于40000u的肽，由此可知水解时间对样品分子量分布的影响规律，结果见表5。

由图8可知，水解过程中红豆蛋白分子量的变化是一个渐进的过程，红豆蛋白经过从眎到胨，最后变成小肽。由图8和表5可知，随着水解度的逐渐增大，样品中分子量小于40000u的肽的百分比逐渐增大，但在水解大于4h后略有波动，分析由于水解4h后一部分未能通过0.22μm微滤膜的蛋白被水解，导致大于100000u的百分比增加，而在水解4.5h后该部分蛋白进一步水解为肽。从图8还可以看到洗脱谱图中始终存在分子量大于100000u的高峰，说明红豆蛋白中始终存在一些不容易被水解的蛋白成分，而且红豆蛋白的水解过程是不均匀的。

表5 酶解时间与水解蛋白分子量分布的关系Table 5 Protein molecular distribution as a function of hydrolysis time

3 结论

3.1 利用响应面分析方法对水酶法提取红豆蛋白的酶解工艺参数进行了优化，得到了最优酶解工艺条件为：pH9.4，加酶量3.14%，温度60℃，时间3.5h，料液比1∶6.9。此酶解工艺条件下多肽得率可达到84.29%左右。

3.2 红豆的水解是不均匀的过程，采用Protex 6L水解4.5h后，凝胶过滤层析结果显示水解物中仍然含有大量的大分子肽，说明红豆蛋白中始终存在一些不容易被水解的蛋白成分。

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Study on enzymolysis extraction of red bean peptide from red bean powder by Protex 6L

LIU Qi1，JIANG Lian-zhou1，2，*，LI Yang1，2，WANG Mei1，WANG Sheng-nan1，QI Bao-kun1
（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.The National Research Center of Soybean Engineering and Technology，Harbin 150030，China）

The red bean peptide was extracted from red bean by the aqueous enzymatic method using Protex 6L.The results showed that optimum conditions with response surface analysis were：enzyme amount 3.14%，hydrolysis temperature 60℃，enzymolysis time 3.5h，the ratio of solid to liquid 1∶6.9，pH9.4.The molecular masses of the hydrolysates were determined with Sephadex G-75 gel filtration chromatography.It showed that red bean contained some stable components which were difficult to hydrolyze with Protex 6L and the process of red bean hydrolysis was disproportional.

Protex 6L；enzymolysis；red bean peptide；response surface experiment

TS201.2

A

1002-0306（2012）07-0191-05

赤豆，又称小豆、赤小豆、红豆，为豆科植物赤小豆或是赤豆干燥成熟的种子，其色泽为鲜红、淡红或深红[1]。赤豆中蛋白质含量平均为22.65%，比禾谷类蛋白质含量高2~3倍，氨基酸种类齐全，含有人类必需的8种氨基酸[2]，营养价值较高。红豆除营养价值外还有较高的药用价值，王彤等人[3]发现食用赤豆对餐后血糖稳定能力优于馒头、眉豆、绿豆，可以作为糖尿病人食用的较为理想的主食之一。代卉等[4]研究了Alcalase水解小麦蛋白制备的肽的抗氧化活性。任海伟等[5]利用碱性蛋白酶与中性蛋白酶对黑豆蛋白进行酶解制备抗氧化肽。林燕等[6]利用木瓜蛋白酶酶解核桃分离蛋白制备小分子活性肽，并对不同分子量段核桃多肽的抗氧化性进行了研究。王永刚等[7]以芸豆蛋白为原料研究芸豆抗氧化活性肽的酶解工艺。孙国威等[8]选择碱性蛋白酶和中性蛋白酶对大豆7S、11S蛋白进行模拟水解，得到不同水平的抗氧化肽肽段，以重均分子量为手段，评价理论模拟与实验水解的相关性。而目前对于利用Protest 6L直接酶解红豆粉方面的研究报道较少，本实验以红豆粉作为原料，对其酶解条件进行研究，得出了Protex 6L酶解提取红豆肽的最佳参数。

2011－07－12 *通讯联系人

刘琪（1989－），在读研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程。

黑龙江省攻关项目（GA09B401-6）；农业部现代农业产业技术体系建设项目（nycytx-004）。