正交试验法优选抗疲劳组方提取工艺

于海斌,郑海云*,龚卫红

(1.中国中医科学院 中医药科技合作中心,北京 100700;2.北京中医药大学 中药学院,北京 100102)

正交试验法优选抗疲劳组方提取工艺

于海斌1,郑海云1*,龚卫红2

(1.中国中医科学院 中医药科技合作中心,北京 100700;2.北京中医药大学 中药学院,北京 100102)

目的通过正交试验，优选抗疲劳组方的最佳提取工艺。方法采用水提取方式，以水为溶剂进行提取，选择加水倍数、提取时间、提取次数3个因素，按照正交试验L9(34)表进行试验。以粗多糖作为指标，综合考虑，选定最优提取工艺。结果提取的最佳工艺条件为加6倍量水，提取2次，每次2 h。结论优选得到的提取工艺简单、稳定、可行。

正交试验；粗多糖

抗疲劳组方含有熟地黄、淫羊藿、枸杞子、西洋参、巴戟天，主要针对肝脾肾亏虚、精气不足所致容易疲劳人群所设。方中熟地黄补血滋阴，益精填髓[1]。主要含有多糖、5-羟甲基糠醛、氨基酸等[2]。淫羊藿补肾阳，强筋骨，祛风湿[1]，主要含有淫羊藿总黄酮、多糖类成分，传统工艺多采用水提。枸杞子滋补肝肾，益精明目[1]，含有枸杞多糖(LBP)、氨基酸、微量元素、维生素等多种化学成分[3]，一般采用水提。西洋参补气养阴，清热生津[1]，其活性成分为总皂苷类、多糖类化合物，西洋参可以水提。巴戟天补肾阳，强筋骨，祛风湿[1]，主要含有糖类、蒽醌类、香豆素类、氨基酸、蛋白质、有机酸、黄酮类、挥发油、甾体、酚类等成分，其提取工艺以水提为佳[4]。以上5味药材均可以水提，主要成分为粗多糖。为了保证制剂质量，用正交设计法研究其最佳提取工艺，分析加水倍数，提取时间，提取次数对粗多糖含量的影响，优选出最佳提取条件。

1 仪器和材料

1.1 仪器

UV-2800H型紫外可见分光光度计[尤尼柯(上海)仪器有限公司]；BP-211D型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)；KQ5200DA型超声波清洗机(张家港市海纳超声电器有限公司)。

1.2 材料

熟地黄、淫羊藿、枸杞子、西洋参、巴戟天饮片均购于北京本草方源药业有限公司。D-无水葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110833-200904)；所用试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 样品的制备

按处方投料，加规定量的水，煎煮规定的时间和次数，滤过，滤液浓缩至稠膏，放入真空干燥箱，干燥得干膏作为样品，进行测定。

2.2 正交试验设计

选用L9(34)正交试验，结合影响该药材提取效率的主要因素，考察药材加水量、提取时间、提取次数对粗多糖含量的影响，同时考虑生产实际，选取3个水平，因素水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

表1 抗疲劳组方提取工艺因素水平

2.3 粗多糖含量的测定

参考《保健食品功效成分检测方法》中“粗多糖的测定方法”[5]，检出限为5.0 mg·L-1，线性范围：0～0.2 mg·mL-1。

2.3.1 对照品溶液制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖对照品2 mg，加水溶解并定容至10 mL，即得0.2 mg·mL-1。

2.3.2 标准曲线的制备 精密吸取D-无水葡萄糖对照品溶液0,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00 mL，分别置于25 mL比色管中，准确补充水至2.0 mL，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，混匀，小心加入浓硫酸10.0 mL，混匀，置沸水浴中煮沸2 min，冷却后用分光光度计在485 nm波长处以试剂空白溶液为参比，1 cm比色皿测定吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。求得回归方程Y=7.784 8X+0.058 2,r=0.999 8，计算试样中粗多糖的含量。

2.3.2 供试品溶液的制备

2.3.2.1 样品提取 取本品适量研细，取约0.2 g，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加水80 mL左右，于沸水浴上加热2 h，冷却至室温后补加水至刻度，混匀，过滤，弃去初滤液，续滤液备用。

2.3.2.2 沉淀粗多糖 精密吸取续滤液50 mL，水浴蒸干，以水5.0 mL溶解，置于50 mL离心管中，加入无水乙醇20 mL，混匀后以3 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液。残渣用80%乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复3次操作。残渣供沉淀葡聚糖用。

2.3.2.3 沉淀葡聚糖 取2.3.2.2项下残渣，用水2.0 mL溶解并转移至20mL离心管中，加入100 g·L-1氢氧化钠溶液2.0 mL，铜试剂溶液2.0 mL，沸水浴中煮沸2 min，冷却后以3 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复3次操作后，残渣用100 mL·L-1硫酸溶液2.0 mL溶解并转移至25 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。此溶液为样品测定液。

2.3.3 样品测定 精密吸取样品测定液2.0 mL置于25 mL比色管中，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，混匀，小心加入浓硫酸10.0 mL，小心混匀，置沸水浴中煮沸2 min，冷却至室温后用分光光度计在485 nm波长处，以试剂空白为参比，1 cm比色皿测定吸光度值。从标准曲线上查出葡萄糖质量，计算样品中粗多糖的含量。同时作样品空白试验。

2.3.4 各组样品测定结果，见表2。

表2 粗多糖提取工艺正交试验结果

注：Yi=Y1+Y2

表3 粗多糖提取工艺方差分析表

注：F0.05(2，11)=3.98；F0.01(2，11)=7.21

2.3.5 结果分析

以粗多糖含量为考察指标，各因素作用的主次为：C﹥B﹥A，方差分析结果表明：B(提取时间)、C(提取次数)影响具有统计学意义(P﹤0.01)；在B因素中B3﹥B2﹥B1，故选择B3；在C因素中，C2﹥C3﹥C1，故选择C2水平，因素A对实验结果影响没有统计学意义，从节约成本角度，选择A1。故水平故最佳工艺为A1B3C2。即6倍量提取2次，每次2 h。

3 验证实验

根据筛选得到最佳提取工艺A1B3C2提取3次，进行验证，结果如下。

表4 验证实验结果 /mg·g-1

4 讨论

中药复方常含多种饮片，若以某个饮片的成分为标准考察提取工艺则不能反映全面，故多选用总成分作为标准。熟地黄、枸杞子、西洋参、巴戟天主要含有多糖类成分，本实验采用比色法进行检验。本方法为保健食品审评专家认可的粗多糖测定方法。但由于方法较为繁琐，在测定过程中，需要操作者仔细认真，确保得到可靠的数据，减少误差。

本实验筛选的工艺，在实验数据的基础上，充分考虑了实际生产的需要，筛选的工艺经过验证，证实稳定可行，可作为抗疲劳组方的提取工艺。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社，2010：116，308，233，123，76.

[2] 朱妍,徐畅.熟地黄活性成分药理作用研究进展[J].亚太传统医药杂志,2011,7(11):173-175.

[3] 王金童,王秀娟.枸杞子的化学成分和药理研究概况[J].天津药学,1999,11(3):14-16.

[4] 沈英超.巴戟天活性物质的研究[D].南京:南京林业大学,2008:1-71.

[5] 王光亚.保健食品功效成分检测方法[M].北京：中国轻工业出版社：2002.

OptimizationofExtractionTechnologyofAnti-physicalFatigueFormulabyOrthogonalTest

YU Hai-bin1, ZHENG Hai-yun1, GONG Wei-hong2

(1.CollaboratingCenterforTCMandScientificTechnology，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China; 2.SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective: To select the best extraction prescription of Anti-physical Fatigue Formula.MethodsThe water extraction method, water as solvent extraction, multiple choice with water, extraction time and number of the three factors, each of the three levels of design, factor levels in Table 1, in accordance with the orthogonal L9(34) Table experiment. Crude polysaccharide considered as the symbol of the selected optimal extraction.ResultsFactors related to RC>RB>RA，extraction times (C) as the main factor. The optimum extraction conditions for 6 times the amount of water, extraction time 2 h, twice.ConclusionThe optimized extraction process is simple, stable and feasible.

Orthogonal extraction；Crude polysaccharide

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郑海云，E-mail:jenny0113@126.com

2012-06-12)