高效液相色谱-质谱法测定血浆中槲皮素及其主要代谢产物

王增仙

（山西生物应用职业技术学院生物制药工程系，山西 太原 030031）

黄酮是广泛存在于植物中的多酚类化合物，槲皮素是黄酮醇类化合物的典型代表，它最显著的特点是抗氧化性强，是植物界分布最广的黄酮类化合物，也是人类饮食中最主要的生物类黄酮。人们日常饮食中的洋葱、苹果、红酒中就含有大量的黄酮醇类化合物［1］。已有的研究结果表明槲皮素具有抗氧化、抗癌防癌、抗炎症反应、调节免疫功能等活性，在防治慢性退行性疾病过程中发挥重要作用［2-4］。槲皮素等黄酮类化合物也是中药及其复方中的主要活性成分之一，受到国内外学者的关注。实验动物或人通过口服摄入槲皮素后，槲皮素在血浆中的物质形式以及代谢产物的情况一直是研究的热点。肠代谢［5］以及体内生物利用度［6］研究表明槲皮素代谢中只有很少或者没有槲皮素糖苷配基存在［7］，其代谢物主要是经由小肠或者肝脏代谢以槲皮素葡萄糖醛酸，槲皮素硫酸盐，氧-甲基化槲皮素以及氧-甲基化槲皮素葡萄糖醛酸的形式存在［8］。陈峰等采用液相色谱-质谱联用法，在大气压电喷雾离子源负离子条件下，测定了大鼠口服槲皮素单体后血浆中槲皮素和异鼠李素［9］。安代志等［10］采用高效液相-质谱联用的方法分析经口给予槲皮素后大鼠门静脉血槲皮素及其代谢产物，结果表明槲皮素处理大鼠门静脉血中可以检测到一定质量浓度的槲皮素以及异鼠李素、柽柳黄素、槲皮素硫酸酯、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸等。本实验通过液相色谱-质谱联用技术测定人口服槲皮素后血浆中的槲皮素及其代谢产物，为研究含槲皮素等黄酮类成分中药及其复方药动学研究以及血样浓度检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 超高效液相色谱-串联质谱仪 (ACQUITY UPLC-Quattro Premier XE，美国 Waters公司)。Milli-Q Synthesis超纯水纯化系统。乙腈(Sigma-Aldrich公司，色谱纯)，甲醇(Sigma-aldrich公司，色谱纯)，甲酸(Sigma-Aldrich公司，色谱纯)，水为Milli-Q超纯水。

槲皮素(批号:Q4951)，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸(批号:90733)，槲皮素-3-O-葡萄糖苷(批号:16654)，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸(自制，经 MS和NMR鉴定)，芹菜素(批号:42251)，抗坏血酸(批号:A5960)购于Sigma-aldrich公司。

1.2 对照品溶液的制备 取槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸对照品适量，精密称定，溶于甲醇，制备成质量浓度为0.05 mg/mL的贮备液。取抗坏血酸适量，精密称定，加入甲醇制备成质量浓度为10 mg/mL的溶液。所得贮备溶液均置于4℃冰箱避光保存。

1.3 超高效液相色谱-质谱测定条件 色谱条件:Waters BEH C18色谱柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)；流动相 A 为1%甲酸水溶液、B为1%甲酸乙腈溶液梯度洗脱，0 min，B为5%；10 min，B为 38%；10～12 min，B为 38%；12～14 min，B为100%；14～14.5 min，B为100% ～5%；14.5～15.5 min，B为5%；体积流量0.40 mL/min；柱温40°C；进样5 μL。质谱条件:仪器为Waters公司Quattro Premier XE串联质谱仪。电喷雾离子源(ESI)，采用负离子模式检测；脱溶剂气流量为600 L/h，脱溶剂气温度为350℃，锥孔气流量为50 L/h，离子源温度为120℃，毛细管电压为3.0 kV，锥孔电压为35 V；选择离子监测模式，检测离子质荷比为301.1(槲皮素)，477.1(槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸)，463.2(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)，491.2(异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸)，269.1(芹菜素)，裂解电压分别为40 V，30 V，40 V，25 V，50 V。

1.4 生物样品制备 血浆样品的处理根据文献［11］进行微小变动后操作。100 μL血浆样品用10 μL 20% 甲酸溶液酸化，加入10 μL抗坏血酸 (10 mg/mL)防止样品处理过程中黄酮类成分的氧化。300 μL乙腈(含400 ng/mL内标物芹菜素)加入到血浆样品中用于沉蛋白以及提取黄酮类化合物。上述血浆样品混悬10 min，超声5 min，在4℃下13000 r/min离心20 min，收集上清液。残渣继续加入300 μL的甲醇按照上述步骤进行第二次提取。合并乙腈与甲醇提取液，真空浓缩至干，提取物用50 μL甲醇和100 μL 1%甲酸水溶液复溶，摇匀，过0.22 μm滤膜，进样分析。

2 方法与结果

2.1 专属性考察 分别取空白血浆、均匀混合的槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸的混合对照品溶液以及加入内标芹菜素的健康受试者给药后收集的血浆样品，依1.4项方法操作，得图1。由图可以看出各物质分离度较好，槲皮素的保留时间约为8.09 min，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸的保留时间约为5.26 min，槲皮素-3-O-葡萄糖苷的保留时间约为5.25 min，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸的保留时间约为6.38 min，内标芹菜素的保留时间为9.39 min。结果表明，采用选择离子模式，空白血浆中内源性物质不干扰目标物的测定。

图1 UPLC-MS色谱图

2.2 线性关系考察 精密吸取上述对照品贮备液，稀释成0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 μg/mL的对照品溶液，分别注入液质联用仪，按上述条件测定槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸的吸收峰峰面积，以进样量为横坐标(x)，以峰面积积分值为纵坐标(y)，进行回归处理，上述物质回归方程分别为:y=2.43x+98.708，r=0.9970(槲皮素)；y=1.71x+22.083；r=0.9997(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)；y=1.191x+16.294，r=0.9996(槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸)；y=0.78x+18.861，r=0.9980(异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸)。结果表明，槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸对照品分别在5～1280 ng/mL范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验 精密吸取槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸对照品溶液各2 μL，重复进样6次，测定槲皮素，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸对照品的峰面积，槲皮素峰面积的RSD为1.67%，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸峰面积的RSD为1.92%，槲皮素-3-O-葡萄糖苷峰面积的RSD为2.33%，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸峰面积的RSD为2.15%。

2.4 稳定性实验 取供试品溶液1份，分别于0、0.5、1、2、4、8、16 h 进样测定，槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸积分面积的RSD分别为3.68%，2.97%和4.52%，表明供试品溶液在16 h内稳定。

2.5 重复性实验 取同一供试品溶液约100 μL，平行制备6份，按样品的测定方法进行测定，计算槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，槲皮素-3-O-葡萄糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸质量浓度，结果RSD分别为2.53%，3.16%和3.42% ，表明本方法重复性较好。

2.6 提取回收率 以槲皮素-3-O-葡萄糖苷为例，将槲皮素-3-O-葡萄糖苷标准液加入空白血浆中，分别配制5.0，20.0和80.0 μg/L 3个质量浓度的质控样品，每个质量浓度5份，依1.4项方法操作，记录槲皮素-3-O-葡萄糖苷的峰面积A血浆；另取高、中、低3个质量浓度槲皮素-3-O-葡萄糖苷质控液，经流动相稀释10倍后直接进样分析，每个质量浓度5份，记录槲皮素-3-O-葡萄糖苷的峰面积A标品，则血浆中槲皮素-3-O-葡萄糖苷提取回收率(%)=A血浆/A标品×100%，相对回收率用实测质量浓度平均值与标示质量浓度的比值百分数(%)表示，结果见表1。结果表明日间、日内精密度及相对回收率均满足生物样品分析的要求。代谢物槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷酸经同样方法测定，结果表明也满足生物样品分析的要求。

表1 血浆样品中槲皮素-3-O-葡萄糖苷的回收率与精密度(n=5)

2.7 样品测定结果 健康男性志愿者(n=6)分别口服槲皮素 200 mg，志愿者分别在服药前、服药后 0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取前臂静脉血4 mL，置肝素抗凝管内、离心(4000 r/min，10 min)分离出血浆，置－80℃冷冻保存备用。依1.4项方法处理血浆样品，本实验测定了0.5，1 h采集血浆中物质浓度来验证本实验方法的可行性。在各分析批次样品中均匀随机放置高、中、低3个质量浓度的质控样品，以此来监控分析过程的有效性。定量测定结果见表2。

表2 样品定量测定结果 (n=5)

3 讨论

3.1 采用UPLC-MS/MS，能够定性人口服槲皮素后血浆样品中槲皮素及其几种代谢产物，例如槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸的保留时间约为5.26 min，槲皮素-3-O-葡萄糖苷的保留时间约为5.25 min，但采用选择离子模式，由于槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸的检测离子质荷比为477.1，槲皮素-3-O-葡萄糖苷的检测离子质荷比为463.2，因此可以准确定性。空白血浆中内源性物质不干扰目标物的测定。

3.2 槲皮素等黄酮类物质很容易氧化，因此在处理过程中加入抗坏血酸防止样品的氧化，同时样品必须在尽可能短的时间内测定。

3.3 通过对人口服槲皮素后血浆中代谢物的研究发现，血浆中检测不到槲皮素原形药物，说明血浆中槲皮素以结合物的形式存在。现有文献报道［12］槲皮素在体内以槲皮素、异鼠李素、柽柳素与葡萄糖醛酸及硫酸形成结合物，通过液相-质谱联用技术确定最终物质形式。

3.4 在有关槲皮素等黄酮类成分的体内药物分析时样品中常加入芹菜素(Apigenin)作为内标物，用以校准和消除由于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。

3.5 通过对人口服槲皮素单体后血浆中的代谢产物的研究，了解槲皮素的入血形式，为含有槲皮素成分的中药材及其复方制剂的药代动力学研究提供科学依据。

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