固定化果胶酶提高苹果出汁率的研究

吴 定，孙嘉文，黄卉卉，谢文娟，郑温翔

(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210003)

固定化果胶酶提高苹果出汁率的研究

吴 定，孙嘉文，黄卉卉，谢文娟，郑温翔

(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210003)

采用固定化果胶酶处理红富士苹果浆，在苹果浆pH值、固定化果胶酶水解温度、固定化果胶酶使用质量和固定化果胶酶水解时间对苹果浆出汁率的影响等单因素试验的基础上，采用响应面法分析，探索固定化果胶酶提高苹果浆出汁率的最佳条件。最佳工艺条件为苹果浆适宜pH3.43、固定化果胶酶与苹果浆质量比为1:15、酶促反应温度49.4℃、酶促反应时间3.50h。固定化果胶酶反复使用10次时，苹果浆的出汁率为62.421%，与对照组相比仍提高约13%。

固定化果胶酶；红富士苹果；出汁率；响应面法

苹果是世界上种植和消费最为广泛的水果[1]，苹果汁是世界上消费量仅次于橙汁的果汁[2]。苹果中含有丰富的维生素、矿物质、有机酸、还原糖等营养物质[3]。苹果和苹果制品中还含有多种生物活性物质，如多酚以及各种食用纤维等[4-5]。苹果汁的制取方法有压榨、挤压、离心和萃取[6-9]。苹果中含有果胶，会影响苹果的出汁率和澄清度，使用果胶酶可以提高苹果的出汁率和澄清度，改善果汁品质[10-15]。

固定化酶与游离酶相比，稳定性有较大提高，对温度和pH值的适应范围增大，对抑制剂和蛋白酶的敏感性降低；反应完成后可通过简单的方法回收酶，酶活力下降不多，并且可以重复使用，也便于产品的分离和纯化；实现批量或连续操作的可能，适于产业化、连续化、自动化生产[16-21]。

目前，利用酶法提高苹果出汁率的研究多停留在利用游离酶制剂或混合游离酶制剂的阶段，也有人利用物理包埋法制备固定化果胶酶以提高苹果出汁率[21]，但未见用化学偶联法固定果胶酶以提高苹果出汁率。本研究采用以戊二醛偶联法制备的固定化果胶酶处理苹果浆，探索提高其出汁率的最佳条件，为以化学偶联法制备的固定化果胶酶在苹果汁生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红富士苹果 南京市五所村农贸市场；固定化果胶酶 南京财经大学生物工程实验室自制；其他试剂均为分析纯；所用水均为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

SQ2008型多功能食品加工机 上海帅佳电子科技有限公司；80-2型离心机 江苏省金壇市荣华仪器制造有限公司；CHA-S型恒温振荡器 国华企业；PHS-3C型精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；YJ501型超级恒温器 上海跃进医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 苹果浆的制备

选取新鲜、无害虫、无霉烂苹果，去除果皮和果核，切块，用打浆机将苹果打浆3次，每次8s，得到苹果浆。

1.3.2 固定化果胶酶在不同条件下对苹果出汁率的影响

称取30g苹果浆，调节其pH值，加入一定质量的固定化果胶酶，在一定温度下振荡反应一定时间后，取出固定化果胶酶，将处理后苹果浆在3600r/min离心20min，测定苹果渣质量，计算其出汁率。

1.3.2.1 酶水解反应温度对苹果浆出汁率的影响

调节苹果浆pH3.6，分别称取5份苹果浆，每份30g，预热5min后，分别加入3g固定化果胶酶，在40、45、50、55、60℃条件下振荡反应2.0h。然后按照上述操作，设平行实验，计算苹果浆的出汁率(以未加果胶酶为对照组)。

1.3.2.2 苹果浆pH值对苹果浆出汁率的影响

分别称取5份苹果浆，每份30g，调节pH值分别为3.2、3.4、3.6、3.8、4.0，预热5min后，分别加入3g固定化果胶酶，在最适宜的温度下振荡反应2.0h。然后按照上述操作，设平行实验，计算苹果浆的出汁率(以未加果胶酶为对照组)。

1.3.2.3 固定化果胶酶使用质量对苹果浆出汁率的影响

苹果打浆，调节最适宜pH值后，分别称取6份苹果浆，每份30g，预热5min后，分别加入0、1、2、3、4、5g固定化果胶酶，在最适宜的温度下振荡反应2.0h。然后按照上述操作，设平行实验，计算苹果浆的出汁率(以未加果胶酶为对照组)。

1.3.2.4 酶水解反应时间对苹果浆出汁率的影响

苹果打浆，调节最适宜pH值后，分别称取6份苹果浆，每份30g，预热5min后，加入最适宜比例的固定化果胶酶，在最适宜的温度下分别反应0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h。然后按照上述操作，设平行实验，计算苹果浆的出汁率(以未加果胶酶为对照组)。

1.3.3 响应面优化试验

根据单因素试验结果，以反应温度、苹果浆pH值、反应时间为影响因素进行响应面设计，因素水平见表1。使用最适宜比例的固定化果胶酶，以苹果浆出汁率为响应值，对试验结果进行回归分析，确定苹果浆出汁率的最佳试验工艺参数。

表1 固定化果胶酶提高苹果出汁率响应面优化试验因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.4 固定化果胶酶使用次数对苹果出汁率的影响

苹果浆调节最适宜pH值后，分别制备10组。每组3份，每份称取30g置于三角瓶中，其中两份为实验样品，一份为对照样品。样品预热5min后，两份实验样本分别加入最适宜比例的固定化果胶酶振荡反应最适宜的时间后，将固定化果胶酶取出，再加入另一组的苹果浆中，如此反复10次，将反应后的苹果浆离心，计算其出汁率(以未加果胶酶为对照组)。

2 结果与分析

2.1 固定化果胶酶提高苹果出汁率单因素试验

2.1.1 酶水解反应温度对苹果浆出汁率的影响

图1 反应温度对苹果浆出汁率的影响Fig.1 Effect of reaction temperature on the yield of apple juice

在40～60℃温度范围内，对照组的出汁差异较小，平均为48.23%。由图1可知，使用固定化果胶酶处理苹果浆，在一定温度范围内随着温度的增加，苹果浆的出汁率逐渐增加，在45～50℃范围内达到最大；随后苹果浆出汁率降低，在55～60℃范围内出汁率下降速度较快，可能是由于高温使部分果胶酶丧失活性。

2.1.2 苹果浆pH值对苹果浆出汁率的影响

苹果浆pH值可影响固定化果胶酶的活性，但对对照组的出汁率几乎没有影响，平均出汁率为48.60%。由图2可知，苹果浆在pH3.4时，固定化果胶酶的作用效果最好，随着pH值升高后，苹果浆的出汁率逐渐降低。

图2 苹果浆pH值对苹果浆出汁率的影响Fig.2 Effect of pH on the yield of apple juice

图3 固定化果胶酶的使用质量对苹果浆出汁率的影响Fig.3 Effect of immobilized pectinase amount on the yield of apple juice

2.1.3 固定化果胶酶使用质量对苹果浆出汁率的影响由图3可知，对照组的出汁率为48.85%，而实验组出汁率均大于75%以上。而当果胶酶使用质量达到2g

水平后，过量的果胶酶并未促进出汁率的增加；固定果胶酶使用量为2g时，苹果浆出汁率已经达到较高水平，出汁率为80.31%。

2.1.4 酶水解反应时间对苹果浆出汁率的影响

图4 反应时间对苹果浆出汁率的影响Fig.4 Effect of hydrolysis time on the yield of apple juice

由图4可知，对照组的出汁率43.76%，而在试验时间内苹果浆出汁率随着固定化果胶酶酶水解时间的增加而增加，反应时间达到3h时，苹果浆出汁率达到较高水平且趋于稳定，这时出汁率达76.33%。

2.2 响应面优化设计试验

2.2.1 响应面优化试验设计与结果

综合上述单因素试验，利用Box-Behnken试验设计原理，试验设计及结果见表2。共16个试验，包括12析因试验和4个检验误差的零点试验。

表2 固定化果胶酶提高苹果出汁率响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

经多项回归分析得到二次回归方程：

表3 响应面二次回归方程模型方差分析结果Table 3 Analysis of variances for the developed quadratic regression model

对二次回归方程模型进行方差分析，结果见表3。由表3可知，该模型高度显著(P=0.0001＜0.01)，失拟项(P=0.0742＞0.05)不显著。R2=0.9886，表明苹果浆出汁率的预测值与实际值之间有很好的拟合度。R2Adj＝0.9716，表明变异中仅有2.84%不能用模型来解释。RSN=24.252(远远大于4)，因此可用此模型分析和预测固定化果胶酶在苹果出汁率应用中的工艺条件。该模型中，反应温度和苹果浆pH值都为显著影响因素，三因素对固定化果胶酶活力的影响顺序为苹果浆pH值＞反应温度＞反应时间。

2.2.2 响应面分析

图5 各两因素交互作用对苹果浆出汁率影响的响应面及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for the interactive effects of three hydrolysis parameters on the yield of apple juice

由图5a可知，反应时间为3.00h，当温度一定时，苹果浆的出汁率随着pH值的增加先增加后减小；当pH值一定时，随着温度的升高，苹果浆的出汁率随着温度的增加也是先增加后减小；在pH3.40、50℃时出汁率达到最大。由图5b可知，pH值为3.40，当温度一定时，苹果浆的出汁率随着反应时间的延长，先降低后增加但变化较小，说明反应时间对出汁率的影响较小；在反应时间一定时，苹果浆出汁率随着温度的增加先增加后降低；在温度50℃，反应时间3.00h时达到最大。由图5c可知，反应温度为50℃，当pH值一定时，苹果浆的出汁率随着反应时间的延长，先降低后增加但变化较小，说明反应时间对出汁率的影响较小；在反应时间一定时，苹果浆的出汁率随着pH值的增加先增高后降低；在pH3.40，反应时间为3.00h时达到最大。

2.3 最优工艺及验证实验

利用Expert软件，解响应面二次回归方程，当出汁率达最大值(79.53%)时，最大值点(A，B，C)＝(－0.124，0.15，1.0)，换算为实际工艺参数(反应温度49.4℃、苹果浆pH3.43、反应时间3.50h)。

进行回归模型可靠性验证实验，设计两组平行实验。进行两组平行实验得到苹果浆出汁率为78.40%，与模型预测值吻合度较高，进一步验证了该模型的可行性。

2.4 固定化果胶酶使用次数对苹果浆出汁率的影响

图6 固定化果胶酶使用次数对苹果浆出汁率的影响Fig.6 Effect of number of repeated uses of immobilized pectinase on the yield of apple juice

由图6可知，固定化果胶酶在第4次使用时，果胶酶活力下降较多，果胶酶在使用4次后苹果浆出汁率由78.40%降到65.08%，在以后的使用中，苹果浆的出汁率略微下降。在第10次使用时苹果浆出汁率仍然达到62.42%，与对照组(49.09%)相比，出汁率仍提高约13%。

3 结 论

3.1 单因素试验结果表明，反应温度50℃、苹果浆pH3.40、固定化果胶酶与苹果浆质量比1:15，反应时间3h时，固定果胶酶对苹果浆的处理效果最好。

3.2 通过响应面法分析，建立固定化果胶酶提高苹果浆出汁率的工艺参数模型，回归方程决定系数为

0.9886，模型显著，拟合度好，具有实际指导意义。得到最佳工艺为反应温度49.4℃、苹果浆pH3.43、反应时间3.50h。在该工艺条件下处理苹果浆，固定化果胶酶在使用第10次时，苹果浆的出汁率为62.42%，比对照组出汁率提高约13%。

[1] KOYUNCU H, KUL A R,ALlMLI A, et al. Adsorption of dark compounds with bentonites in apple juice[J]. LWT-Food Science and Technology, 2007, 40(3): 489-497.

[2] NAKKEERAN E, UMESH-KUMAR S, SUBRAMANIAN R. Aspergillus carbonarius polygalacturonases purified by integrated membrane process and affinity precipitation for apple juice production[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(3): 3293-3297.

[3] 罗兴武, 胡晶, 唐巧玉. 萝卜汁与苹果汁复合饮料的研制[J]. 食品研究与开发, 2005, 26(1): 104-106.

[4] OSZMIANSKI J, WOJDYLO A, KOLNIAK J. Effect of pectinase treatment on extraction of antioxidant phenols from pomace, for the production of puree-enriched cloudy apple juices[J]. Food Chemistry, 2011, 127(2): 623-631.

[5] WILL F, ROTH M, OLK M, et al. Processing and analytical characterization of pulp-enriched cloudy apple juices[J]. LWT-Food Science and Technology, 2008, 41(10): 2057-2063.

[6] 杨大浩. 国内外苹果榨汁技术及设备[J]. 粮油加工与食品机械, 1986 (6): 1-9.

[7] 张绍英, 曹文龙, 魏文军. 钝击破碎对苹果压榨效果的影响[J]. 农业工程学报, 2008, 24(2): 246-249.

[8] ISRAEL S, LEUFSTEDT G, 李平. 果汁离心提取工艺[J]. 中国果菜, 1993(3): 13-16.

[9] 黄运华, 乔存炎. 萃取果蔬汁新技术[J]. 食品工业, 1983(1): 25-27.

[10] ARAYA-FARIAS M, MONDOR M, LAMARCHE F, et al. Clarification of apple juice by electroflotation[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2008, 9(3): 320-327.

[11] YU J, LENCKI R W. Effect of enzyme treatments on the fouling behavior of apple juice during microfiltration[J]. Journal of Food Engineering, 2004, 63(4): 413-423.

[12] RODRIGUEZ-NOGALES J M, ORTEGA N, PEREZ-MATEOS M, et al. Pectin hydrolysis in a free enzyme membrane reactor: An approach to the wine and juice clarification[J]. Food Chemistry, 2008, 107(1): 112-119.

[13] RAI P, MAJUMDAR G C, DASGUPTA S, et al. Optimizing pectinase usage in pretreatment of mosambi juice for clarification by response surface methodology[J]. Journal of Food Engineering, 2004, 64(3): 397-403.

[14] 杨建军, 马齐, 宋宏新. 复合酶在苹果汁加工中的应用研究[J]. 食品科技, 2005, 30(3): 76-78; 82.

[15] 杨辉, 陈永康, 张智峰, 等. 果胶酶提高苹果出汁率工艺条件的优化[J]. 食品科技, 2006, 31(5): 76-78.

[16] SARTOGLU K, DEMIR N, ACAR J, et al. The use of commercial pectinase in the fruit juice industry, part 2: determination of the kinetic behavior of immobilized commercial pectinase[J]. Food Engineering, 2001, 47(4): 271-274.

[17] ALKORTA I, GARBISU C, LLAMA M J, et al. Immobilization of pectin lyase from Penicillum italicum by covalent binding to nylon[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1996, 18(2): 141-146.

[18] 张慧. 固定化酶在食品工业中的应用研究[J]. 安徽农学通报, 2008, 14(16): 10-12.

[19] 陈建龙, 祁建城, 曹仪植, 等. 固定化酶研究进展[J]. 化学与生物工程, 2006, 23(2): 7-9.

[20] WU Shaogui, LIU Bailing, LI Songjun. Behaviors of enzyme immobilization onto functional microspheres[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2005, 37(5): 263-267.

[21] 陈松河, 林耀辉, 刘新民, 等. 固定化果胶酶澄清果汁的条件及效果[J]. 亚热带植物通讯, 1996, 25(2): 6-12.

Improvement of Apple Juice Yield Using Immobilized Pectinase

WU Ding，SUN Jia-wen，HUANG Hui-hui，XIE Wen-juan，ZHENG Wen-xiang
(College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China)

Immobilized pectinase was used to treat Red Fuji apple pulp to improve juice yield. One-variable-at-a-time experiments were conducted to investigate the effects of pH, hydrolysis temperature, enzyme dose and hydrolysis time on juice yield. Further, response surface methodology was employed to optimize the hydrolysis parameters. The optimal hydrolysis conditions were found as follows: pH 3.43, 1:15 of enzyme/substrate ratio, 49.4 ℃ of hydrolysis temperature, and 3.50 h of hydrolysis time. After tenth repeated use, the immobilized enzyme resulted in a juice yield of 62.421%, which was increased by approximately 13% compared with the control.

immobilized pectinase；Red Fuji apple；apple juice yield；response surface methodology

Q814.9

A

1002-6630(2012)16-0040-05

2011-07-04

江苏省教育厅实践创新项目(SJ0913)

吴定(1962—)，男，教授，硕士，主要从事食品生物工程研究。E-mail：Foodfermentation@163.com