荧光分析法测定肉类食品中诺氟沙星的残留

蔡其洪，许桂芬，阮丽琴，李春来

（1.莆田学院 医学院，福建 莆田 351100；2.食品安全分析与检测教育部重点实验室（福州大学），福建 福州 350108）

诺氟沙星（Norfloxacin，NFLX）又名氟哌酸，为第三代喹诺酮类抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强，毒副作用低和临床疗效高的特点，是临床应用最广泛的喹诺酮类药物之一.诺氟沙星系化学合成药物，合成容易，价格低廉，故也是动物和水产养殖中最重要的抗感染药物之一，然而由于滥用现象严重，导致药物残留，给食品安全带来严重的威胁.该类药物的残留除其本身的毒副作用对人体造成直接危害外，更为严重的是人类长期食用含较低浓度药物的动物源性食品，容易诱导人类致病菌产生耐药性，从而影响该类药物的临床疗效.

目前诺氟沙星的测定方法主要有紫外分光光度［1-2］，高效液相色谱法［3-5］，荧光分析法［6-8］.由于荧光法具有灵敏度高、选择性好的特点，是应用最广泛的方法［9］.其中应用Al3＋荧光增敏测定诺氟沙星，并用于滴眼液、胶囊［10］和牛奶［11］中诺氟沙星的测定.而荧光分析法用于肉类食品中诺氟沙星药物残留的检测还未见文献报道，且本文所建立的荧光法具有更低的检出限（0.032ng·mL-1），特别适用于痕量药物残留的检测，且样品前处理方法简单，用于实际肉类样品中诺氟沙星含量的测定，所得结果令人满意.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4600荧光分光光度计（日本日立公司）；超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；万分之一电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；离心机（上海手术器械厂），PHS-3C酸度计（上海精密科学仪器公司）.

诺氟沙星（中国药品生物制品检定所，99.2%），标准溶液质量浓度为100μg·mL-1，Al3＋标准溶液是用 Al（NO3）3（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）配成浓度为0.1mol·L-1，实验所需的各种肉类食品为市场上随意购买，其他所用试剂均为分析纯，水为纯净水.

1.2 样品前处理方法

取2g经绞碎的各种肉类食品，每次加入10 mL pH＝4的盐酸溶液超声提取三次，每次10 min，各离心10min（3 000r／min），合并三次上清液，加入1mL的Al3＋标准溶液，定容至50mL，待测.

1.3 测定方法

于5mL的具塞刻度试管中配制NFLX-Al3＋的最佳体系溶液，使体系溶液中CAl3＋＝2.0mmol·L-1、pH＝4.0，静置5min，取试液置于1cm×1cm石英液池中，设置激发和发射单色仪狭缝宽度均为5nm，扫描速度为1 200nm·min-1，利用荧光分析法测定.

2 结果与讨论

2.1 金属离子的选择

许多金属离子可与诺氟沙星发生络合反应，使荧光强度发生变化.实验考察了Al3＋、Fe3＋、Fe2＋、Mg2＋、Zn2＋、Cu2＋和 Ni2＋等七种不同金属离子与诺氟沙星配位反应后荧光强度的变化，结果发现Al3＋、Fe2＋、Mg2＋和Zn2＋与诺氟沙星配位后荧光强度增强，增强的顺序为Al3＋＞Zn2＋＞Fe2＋＞Mg2＋；而 Fe3＋、Cu2＋和 Ni2＋使诺氟沙星的荧光强度受到猝灭.因此，我们选择Al3＋增强诺氟沙星的荧光强度作为分析测定的条件，其荧光光谱变化如图1.

图1 0.1μg·mL-1NFLX和NFLX-Al 3＋的荧光激发和发射光谱Fig.1 Excitation and emission spectra of 0.1μg·mL-1 NFLX and NFLX-Al 3＋

2.2 稳定性实验

实验考察了NFLX-Al3＋反应体系在24h内荧光强度的变化情况.结果可得从0～5min之内，体系的荧光强度呈递增状态，从5min到24h之间，荧光强度的变化在3%以内，因此实验选择NFLX-Al3＋体系反应5min后进行分析测定.

2.3 pH值的影响

诺氟沙星结构中的氧原子和氮原子在不同酸碱溶液中的质子化程度不同，从而影响发光体系的电子性质以及电子云分布，最后使NFLX-Al3＋体系的荧光性质和强度发生变化.实验选择用1.0mol·L-1盐酸和氢氧化钠溶液调节使NFLX-Al3＋体系中的pH＝0～14，考察在不同pH值溶液中荧光强度的变化，结果如图2所示，当溶液的pH＝4时，NFLX-Al3＋体系的荧光强度最大.

图2 不同pH值溶液中体系荧光强度的变化Fig.2 Fluorescence intensity changes in different pH solutions

2.4 Al 3＋浓度的影响

实验选择诺氟沙星与不同Al3＋浓度进行反应，测量其荧光强度的变化，结果可得当Al3＋浓度达到2.0mmol·L-1时，体系的荧光强度最大且处于稳定，见图3.故实验选择Al3＋浓度为2.0 mmol·L-1作为反应的浓度.

图3 不同Al 3＋浓度对体系荧光强度的影响Fig.3 lnfluence of the concentration of Al 3＋ on relative fluorescence intensity of NFLX-Al 3＋

2.5 样品背景干扰情况

肉类样品的基体复杂，实验考察了各种肉类样品基体的干扰情况，从实验结果可得空白肉类基体主要是内源性蛋白质的干扰，即内源性蛋白质有着较强的荧光强度，但在本实验选取的最佳条件下荧光峰位置λem＝433nm处测定时，内源性蛋白质的荧光强度可以忽略不计，见图4.

图4 0.1μg·mL-1NFLX-Al 3＋（1-1′）和肉类食品（2-2′）的荧光激发和发射光谱Fig.5 Excitation and emission spectra of 0.1μg·mL-1 NFLX-Al 3＋ （1-1′）and meat product（2-2′）

2.6 标准工作曲线和检出限

梯度配制不同浓度的诺氟沙星标准溶液，在最佳实验条件下，荧光法分别测定每一种溶液的荧光强度，以λem＝433nm处的荧光强度对诺氟沙星的浓度作工作曲线，见图5.得诺氟沙星的线性方程为F＝15.89＋36.50C，线性范围为0.5～250ng·mL-1，相关系数R＝0.999 9，方法的检出限为0.032ng·mL-1.

2.7 精密度实验

配制6份相同质量浓度为10ng·mL-1的诺氟沙星溶液，在一定的实验条件下进行荧光法测定，得诺氟沙星的相对标准偏差（RSD）为2.3%.从实验所得结果来看，该方法具有很好的精密度.

图5 诺氟沙星的标准工作曲线Fig.5 Calibration curves of norfloxacin

2.8 加标回收率实验

分别在不含有诺氟沙星的各种肉类食品中加入不同量的诺氟沙星，设定最佳实验条件进行测定，每一份样品平行测定三次，结果取平均值，实验所得数据见表1所示.

表1 各种样品中诺氟沙星的回收率Table 1 Recovery of norfloxacin in every samples

3 结 论

实验采用Al3＋与诺氟沙星配位增强荧光强度，建立了肉类中诺氟沙星药物残留的直接荧光分析法.样品只需通过简单的处理，不需要分离，即可用于复杂肉类基体中诺氟沙星药物残留的痕量测定，且实验结果具有很好的准确度、灵敏度和选择性.

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