响应面分析法优化艾叶中绿原酸提取工艺

刘益红，周建军，徐顶巧

（陕西理工学院，生物科学与工程学院，陕西汉中 723000）

响应面分析法优化艾叶中绿原酸提取工艺

刘益红，周建军*，徐顶巧

（陕西理工学院，生物科学与工程学院，陕西汉中 723000）

目的：探索艾叶中绿原酸的醇提工艺。方法：以乙醇为溶剂，在单因素实验的基础上，选取提取次数、提取温度、提取时间、料液比为自变量，绿原酸的得率为响应值，采用中心组合设计的方法，利用响应面分析方法，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型。结果：艾叶中绿原酸醇提工艺的最佳条件为60%乙醇为提取溶剂、料液比1∶13、提取温度63℃、提取次数3次、提取时间60min，在此条件下，绿原酸的得率为0.820%。结论：通过对绿原酸提取工艺的研究，艾叶中绿原酸的提取率达94.04%。

艾叶，绿原酸，响应面分析法

艾（Artem isia argyi Lévl.et Vant.）是菊科（Compositae）蒿属（Artemisia L.）多年生草本植物[1]。全草有调经止血﹑安胎止崩﹑散寒除湿之效。由于艾蒿适应能力强，栽培也比较容易，全国大部分地区均有分布[1]。艾叶为艾蒿的叶[2]，艾叶药用历史悠久，最早记载于《中医别录》[3]。《本草纲目》记载：艾以叶入药，性温、味苦、无毒、纯阳之性、通十二经，具回阳、理气血、逐湿寒、止血安胎等功效，亦常用于针灸。具有温经止血、散寒止痛、镇咳平喘、止漏安胎和燥湿止痒等功效[4]，故又被称为“医草”。据文献报道，艾叶中含有挥发油、三萜类、桉叶烷类、黄酮类[5]、绿原酸[6]、脂肪酸类[7]等活性物质。其中，绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有清除自由基、抗菌、消炎、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、降血压、降血脂和兴奋中枢神经系统等作用[8]。目前，绿原酸的提取大多采用金银花、向日葵、杜仲叶等植物[9]，除杜仲叶外，其它材料本身成本较高。而艾草资源丰富，易得，且绿原酸含量也较高，可作为又一种提取绿原酸的植物资源，但是国内还没有关于从艾草中提取绿原酸的报道。鉴于此，本实验采用有机溶剂提取法通过单因素实验和响应面分析法对料液比、提取温度、提取时间、提取次数进行筛选，以确定艾草中绿原酸提取的最佳工艺，为艾叶中绿原酸的深入研究及开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

艾叶 于四月中旬采自陕西理工学院校园，经陕西理工学院杨培君教授予以鉴定，供试材料于40℃干燥，参照2005版药典[4]方法进行提取，经HPLC测定艾叶中绿原酸含量为0.872%；绿原酸标准品 中国生物制品研究所，供检测用；甲醇 天津市博迪化工有限公司，分析纯；乙腈 天津科密欧化学试剂开发中心，色谱纯；磷酸 西安化学试剂厂，分析纯；工业乙醇 购自汉中兴汉化学试剂厂，95%。

Waters e2695-2489高效液相色谱系仪 配有2489紫外检测器和Empower色谱工作站，美国Waters公司；FW-177型中药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；AB204-S电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；HH 6型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；SHB-95循环水式多用真空泵 郑州杜甫仪器厂；302型电热鼓风干燥箱 山东潍坊医药集团股份有限公司医疗器械厂；UPH-Ⅱ-40型优普超纯水机 成都超纯科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分析方法 HPLC法[4]。

1.2.2工艺流程

1.2.3 绿原酸含量测定

1.2.3.1 色谱条件 参照2005版《中国药典》的方法[4]，色谱柱为Inertsil ODS-3（5μm，4.6×150mm），流动相为乙腈∶0.4%磷酸（10∶90），流速1.0m L·m in-1，柱温为室温，检测波长327nm，进样量10μL，理论塔板数大于3000。

1.2.3.2 标准曲线的建立 精密称取绿原酸对照品9.0mg置于500m L棕色容量瓶中，加甲醇溶解定容，即配成18μg·m L-1的储备液。分别精密吸取0.5、1、2、4、8m L储备液置于10m L容量瓶，用甲醇定容至刻度，即配成0.9、1.8、3.6、7.2、14.4μg·m L-1五个不同浓度的标准溶液。

按照1.2.3.1的色谱条件进样，分别测出五个不同浓度的标准品溶液的峰面积，以绿原酸的峰面积为纵坐标，以绿原酸浓度（μg·m L-1）为横坐标绘制标准曲线，其回归方程为：Y=51100X-5130（R=0.9996），其浓度在0.9～14.4μg·m L-1范围内，线性关系良好。绿原酸对照品色谱图见图1，绿原酸标准曲线见图2。

图1 绿原酸对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of chlorogenic acid standard

图2 绿原酸标准曲线Fig.2 Standard curve of chlorogenic acid

1.2.3.3 供试品溶液的制备 参照2005版药典[4]，精密称取艾叶粉末1.0000g，置50m L三角瓶中，加50%甲醇25m L，混匀，称重，60℃水浴30m in，静置放冷后，称重，补齐重量，混匀待测。

1.2.3.4 样品中绿原酸含量的测定 取制备液1m L加甲醇稀释至10m L，经0.45μm样品过滤器过滤，按标准同样的色谱条件测定，并计算绿原酸含量和得率。绿原酸样品色谱图见图3。

绿原酸得率（%）=样品中绿原酸含量×样品溶液体积/样品干重×100%

图3 绿原酸样品色谱图Fig.3 Sample chromatogram of chlorogenic acid

1.2.4 单因素实验 按1∶13加入提取溶剂，水浴65℃，提取3次，每次60m in，分别将提取溶剂设为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，以考察乙醇浓度对绿原酸得率的影响；以60%乙醇作为溶剂，其它条件固定不变，分别将温度设为40、50、60、70、80℃，以考察提取温度对绿原酸得率的影响；其他条件固定不变，分别将提取时间设为15、30、60、90、120m in，以考察提取时间对绿原酸得率的影响；其他条件固定不变，分别将料液比设为1∶7、1∶10、1∶13、1∶16、1∶20，以考察料液比对绿原酸得率的影响；其它条件固定不变，分别将提取次数设为1、2、3、4次，以考察提取次数对绿原酸得率的影响。

1.2.5 响应面实验 在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合原理，选取提取次数X1、提取温度X2、提取时间X3、料液比X4共4个对绿原酸提取影响显著的因素，以绿原酸得率为响应值，采用4因素3水平的响应面分析法，得到二次回归方程，并找出最佳工艺参数。实验设计如表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Variables and levels in response surface design

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果及分析

2.1.1 乙醇浓度对绿原酸得率的影响 乙醇浓度对绿原酸得率的影响结果见图4。由图4可知，绿原酸得率随醇浓度增加而增加，在乙醇浓度为60%时绿原酸的得率达最大值，之后呈递减趋势。故提取溶剂以60%乙醇为宜。

图4 乙醇浓度对绿原酸得率的影响Fig.4 Effectof alcohol concentration on extraction yield

2.1.2 提取温度对绿原酸得率的影响 提取温度对绿原酸得率的影响结果见图5。由图5可知，绿原酸得率随提取温度升高先增加，在60℃达最大值，之后随温度增高而降低。故提取温度以60℃为宜。

图5 提取温度对绿原酸得率的影响Fig.5 Effectof extraction temperature on extraction yield

2.1.3 提取时间对绿原酸得率的影响 提取时间对绿原酸得率的影响结果见图6。由图6可知，绿原酸得率随提取时间增加而增大，在60m in达最大值，之后随提取时间增加而降低。故提取时间以60min为宜。

图6 提取时间对绿原酸得率的影响Fig.6 Effectof extraction time on extraction yield

2.1.4 料液比对绿原酸得率的影响 料液比对绿原酸得率影响结果见图7。由图7可知，绿原酸得率随料液比增大呈递增趋势，在料液比达到1∶13后，绿原酸得率随料液比增加基本保持稳定，考虑到工业生产成本，故料液比选取1∶13。

图7 料液比对绿原酸得率的影响Fig.7 Effectof solid－liquid ratio on extraction yield

2.1.5 提取次数对绿原酸得率的影响 提取次数对绿原酸得率的影响结果见图8。由图8可知，绿原酸得率随提取次数增加而增加，但提取3次后再增加提取次数，绿原酸得率增加不明显。故提取次数以3次为宜。

图8 提取次数对绿原酸得率的影响Fig.8 Effectof extraction times on extraction yield

2.2 响应面实验结果与分析

响应面分析方案及实验结果见表2，表中1～24号是析因实验，25～29号是中心实验。29个实验点为分析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点实验重复5次，用以估计实验误差。

用软件Design expert 8.0.对所得数据进行回归分析，回归分析结果见表3。对各因素回归拟合后，得到回归方程：

从表3可以看出，用上述回归方程描述各因素与响应值的关系时，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著（r=模型平方和/总离差平方和=0.9848），模型的显著水平小于0.0001，说明此模型是高度显著的，该实验方法是可靠的。回归方程各项方差分析，当显著水平小于0.05时，它所对应的条件对响应值的作用是显著的，方程的失拟误差不显著，可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。结果表明，X1、X2、X4、X1X2、X1X3、X2X3、X2X4、X3X4、X12、X22、X32、 X42对实验结果影响显著，因此各实验因子对响应值的影响不是线性关系。对艾草叶中绿原酸得率影响的大小依次为提取次数、料液比、提取温度和提取时间，即提取次数对绿原酸得率的影响最为显著。

RSM方法的图形是特定的响应面Y对应的因素X1、X2、X3、X4构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反映各因素对响应值的影响，从实验所得的响应面分析图上可以找到它们在反应过程中的相互作用。回归优化响应面曲面图见图9～图14。

艾草叶中绿原酸提取最佳工艺条件为：料液比1∶13、提取温度62.55℃、提取次数3次、提取时间58.93min，在此条件下绿原酸得率可达0.823%，提取率（%）=提取液中绿原酸含量/艾草叶中绿原酸含量×100%，达94.38%。

表2 响应面分析方案及实验结果Table 2 Arrangement and experimental results of responsesurface central composite design

图9 时间与温度对绿原酸得率的影响Fig.9 Response surface plot showing the effects of extraction time and temperature on extraction yield of chlorogenic acid

图10 温度与料液比对绿原酸得率的影响Fig.10 Response surface plot showing the effects of extraction temperature andmaterial/water ratio on extraction yield of chlorogenic acid

表3 回归模型方差分析Table 3 ANONA（analysis of variance）of regression equation

考虑实际操作，将最佳工艺修正为料液比1∶13、提取温度63℃、提取次数3次、提取时间60m in，在此条件下称取艾草叶干燥粉末3份各20.0000g，进行三组验证实验。验证实验结果见表4。

由表4可知，实际测得艾草叶中绿原酸的平均得率为0.820%，平均提取率为94.04%，与模型预测值高度相符。

图11 提取时间与料液比对绿原酸得率的影响Fig.11 Response surface plot showing the effects of extraction timeandmaterial/water ratioon extraction yield ofchlorogenic acid

图12 提取温度与提取次数对绿原酸得率的影响Fig.12 Response surface plot showing the effects of extraction times and extraction temperature on extraction yield of chlorogenic acid

图13 提取时间与提取次数对绿原酸得率的影响Fig.13 Response surface plot showing the effects of extraction time and extraction times on extraction yield of chlorogenic acid

图14 料液比与提取次数对绿原酸得率的影响Fig.14 Response surface plot showing the effects of extraction times andmaterial/water ratio on extraction yield of chlorogenic acid

表4 验证实验结果Table 4 The results of confirmatory test

3 结论

本实验通过响应面分析法研究了艾草叶中绿原酸的醇提工艺条件，其中提取次数、提取温度和料液比对艾叶中绿原酸得率的影响极显著。艾叶中绿原酸得率与提取次数、提取温度、提取时间和料液比通过响应面分析软件拟合得到二次回归方程模型，修正该模型后得到最佳工艺参数为料液比1∶13（g·m L-1）、提取温度63℃、提取次数3次、提取时间60min，并通过验证性实验证实，实验所得值与模型预测值高度相符。此法具有成本低、提取率高、操作简单的特点。

[1]王艳荣，何云，苗志国，等.“绿色”饲料添加剂-艾叶的研究进展[J].粮食与饲料工业，2009（10）：38-40.

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Optim ization of extraction technology for chlorogenic acid in leaf of Artem isiae argyi by response surface methodology

LIU Yi-hong，ZHOU Jian-jun*，XU Ding-qiao

（School of Biological Sciences&Engineering，ShaanxiUniversity of Technology，Hanzhong 723000，China）

Ob jective：In order to op tim ize ethanol extraction of chlorogenic acid in leaf of Artem isiae argyi. Method：A mathematical reg ression model for p red icting extraction yield of chlorogenic acid as a function of ratio of independent variab les，inc lud ing extraction times，extrac tion temperature，extraction time and solvent/ material ratio were estab lished through fitting Box-Behnken central composite design experimental results. Interac tive effec ts of the independent variab les on extraction yield of chlorogenic acid were investigated by response surface methodology based on the analysis of sing le-factor experiments.Result：The op timal p rotocol for ethanol extracting chlorogenic acid from leaf of Artem isiae argyi was based on 60%ethanol as solvent，the ratio ofmaterial to solvent of 1∶13（g·m L-1），extraction temperature of 63℃，extrac tion time of 60m in and 3 times extraction，and extraction yield of chlorogenic acid could be up to 0.820%.Conc lusion：The extrac tion ratio of chlorogenic acid in leaf of Artem isiae argyiwas 94.04%.

Artem isia argyi leaf；chlorogenic acid；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2012）09-0263-05

2011－08－01 *通讯联系人

刘益红（1986-），男，硕士研究生，研究方向：植物资源开发与利用。