圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪及其在花青素分离中的应用

裴海闰，曹学丽*

(北京工商大学食品学院，北京 100048)

圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪及其在花青素分离中的应用

裴海闰，曹学丽*

(北京工商大学食品学院，北京 100048)

所研制的圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪采用双分离柱串联设计，公转半径为70mm，β值范围为0.3～0.7，柱总容积为30mL。将所研制的新型分离柱与传统多层缠绕色谱柱对不同溶剂体系的保留能力进行对比，根据溶剂极性不同，分别选择正庚烷-甲醇、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、正丁醇-醋酸-水及聚乙二醇1000-磷酸钾盐-水双水相体系用于固定相保留能力的研究。结果表明：在L-I-T洗脱模式下，当流速为1mL/min时，传统多层缠绕色谱柱和圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪在正庚烷-甲醇体系中的固定相保留率(Sf)分别为50%和60%，在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系中的Sf值分别为60%和68%。在U-O-H洗脱模式下，流速为0.5mL/min时，传统多层缠绕色谱柱和圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪在正丁醇-醋酸-水体系中的Sf值分别为22%和60%；在L-I-T洗脱模式下，流速为0.5mL/min时两种色谱柱在聚乙二醇1000-磷酸钾盐-水双水相体系中的Sf值分别为15%和46%。各个体系下Sf与(1/g-levels)1/2线性相关。将所研制的新型逆流色谱仪初步应用于黑果枸杞花青素样品的分离，对其实际分离纯化能力进行考察研究。采用极性较强的甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(体积比2.5:1.5:1:5:0.001)，在1mL/min的流速下，分离得到纯度89%黑果枸杞花青素。

高速逆流色谱；圆盘嵌入式螺旋管柱；双水相全系；花青素

高速逆流色谱(h ig h-s pee d cou ntercurre nt chromatography，HSCCC)[1]以液-液萃取和离心分配为基础，利用螺旋形柱体在做高速行星式运动时产生的离心力，使互不相溶的两相溶剂不断混合，随流动相引入螺旋形柱体的样品在两相之间反复分配，按分配系数的次序，依次被流动相洗脱出来。目前常用的高速逆流色谱仪都采用J型多层缠绕的聚四氟乙烯螺旋管分离柱设计[2]。溶剂系统的物性参数对固定相保留率有很大的影响，如两相密度差、黏度、界面张力等。Berthod等[3]研究表明，两相的密度差对固定相保留率的影响最大，固定相保留率和密度差基本呈线性关系。流量、转速对固定相保留率影响的研究较多。Du Qizhen等[4]总结出了固定相保留率和流量平方根之间的线性关系。Sutherland等[5-6]发现了流动相线性速率的平方和体积流量之间的线性关系。

由于高速逆流色谱仪是利用螺旋管色谱柱在行星式运动过程中产生的阿基米德螺旋力实现固定相的保留，因此可以通过扩大螺旋管的盘绕螺距来提高固定相的保留率[7]。在传统的螺旋管柱逆流色谱仪中，螺距受到螺旋管外径的限制，由里到外离心力的增长速率缓慢，因而对一些极性强、黏度高的溶剂体系保留能力较弱。近年来，一种在圆盘刻蚀螺旋槽方式的被应用于高速逆流色谱分离柱的设计，可使螺旋槽的螺距明显增加[8-11]。

黑果枸杞(Lycium ruthenicumMurr.)是茄科枸杞属的多年生耐盐、抗旱植物，分布于我国西北地区，其果实中含有丰富的花青素，是天然花色苷类色素的资源。当前花色苷由于其无毒又兼具营养药理作用，在食品医药等领域受到重视[12-14]。目前对黑果枸杞色素的研究还仅限于其粗提取物，对其中花青素的纯品的研究还很少。样品来自中国科学院西北高原生物研究所提供的黑果枸杞色素提取物，将尝试采用甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水(三氟乙酸)体系对该色素提取物中的花青素进行分离纯化。由于该体系在传统多层缠绕HSCCC上的保留率很低(＜20%)，达不到分离的要求，因此考虑在圆盘嵌入式螺旋管HSCCC上进行实验，以期得到较高的保留率，并将其分离。

在已有研究的基础上设计并研制了一种圆盘嵌入式螺旋管柱高速逆流色谱仪样机。通过在一个圆柱形圆盘上设置螺旋槽，并在其中嵌入多层螺旋管的方式设计了一种新型的逆流色谱分离柱；通过一系列实验就其与传统高速逆流色谱仪的保留能力进行比较。同时选取基础体系为甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(1:2.5:1.5:5:0.001)，首先考察该体系在圆盘嵌入式螺旋管HSCCC上的最佳洗脱模式，从中选取最佳的洗脱模式进行分离实验，样品经高效液相色谱检(HPLC)以及高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)检测纯度和推测结构。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果枸杞色素提取物，由中国科学院西北高原生物研究所提供。

正庚烷、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、冰醋酸(均为分析纯) 国药集团化学试剂北京有限公司；甲基叔丁基醚、乙腈、三氟乙酸(均为色谱纯) 美国Fisher公司；蒸馏水自制。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪、Agilent 1100 离子阱质谱仪 美国Agilent公司；圆盘嵌入式螺旋管色谱仪的分离柱 本实验室自制。

1.3 方法

1.3.1 溶剂体系及样品的配制

采用的溶剂体系有正庚烷-甲醇体系(体积比1:1)、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系(体积比1:1:1:1)、正丁醇-醋酸-水体系(体积比4:1:5)、聚乙二醇(PEG)1000-磷酸钾盐-水(pH9.0，质量比12.5:12.5:75)4种体系。根据溶剂体系的组成，在分液漏斗中配制并充分混合，室温静置平衡分层，使用前分离。

样品混合溶液的配制：称取一定量的不同种类的样品溶解于一定体积的上相或下相流动相中，制得混合样品。

1.3.2 高速逆流色谱洗脱模式

在使用高速逆流色谱进行分离时所用的洗脱模式可用3个参数联合进行描述，即流动相的选择-流动相在螺旋槽中的流动方向-色谱柱转向。对于每一种溶剂体系均可有8(23)种不同的分离洗脱模式可供选择。在流动相选择时，对于同一溶剂体系，可选择上相(U)或者下相(L)作为流动相。圆盘嵌入式螺旋管色谱柱其进口端和出口端可以是螺旋槽的内端(I)，也可以是螺旋槽的外端(O)。对一个两端封闭的分离柱而言，无论转动方向如何，管路中互不相溶的两相溶剂都趋于向同一端流动，该端定义为为首端(H)，另一端为尾端(T)。采用的洗脱模式如下：

1)L-I-H：柱体顺时针旋转，以下相为流动相，从螺旋槽的I即此旋转方向时的H，向流通槽的O即T流动。2)U-O-H：柱体逆时针旋转，以上相为流动相，从螺旋槽的O即此旋转方向时的H，向流通槽的I即T流动。3)L-I-T：柱体逆时针旋转，以下相为流动相，从螺旋槽的I即此旋转方向时的T，向流通槽的O即H流动。

1.3.3 固定相保留率的测定

将预先平衡好的两相溶剂体系分离，根据洗脱模式选择其中一相为固定相，另一相为流动相。先用固定相充满整个系统，系统总体积记为Vt，然后调节仪器到预定转速，将流动相以预定流速泵入柱体内，柱体积为Vc，用量筒收集出口端推出的固定相体积。溶剂体系达到平衡时，即出口端无明显固定相流出，测量推出的固定相体积Ve。固定相保留率的计算如式(1)所示。

1.3.4 黑果枸杞花青素检测方法

HPLC条件：色谱柱：TSK Gel ODS-80 Ts QA；流速：0.8mL/min；进样量：20μL；柱温：35℃；检测波长：280、350、525nm；流动相：A：10%甲酸＋0.1% TFA；B：85%乙腈＋15%甲醇；梯度洗脱：0～30min，97%～88.5% A；30～40min，88.5% A；40～60min，88.5%～84.5% A；60～70min，84.5%～84% A；70～80min，84%～77% A；80～100min，77%～97% A。

HPLC-MS条件：离子阱质量分析器；ESI电离源；质核比扫描范围：0～1200m/z；雾化器压力：241kPa；干燥器流量：8L/min；干燥器温度：350℃；电离模式：正、负离子两种模式，并采集MS(1)和MS(2)两级质谱数据。通过质谱分析获取物质的分子质量、特征离子碎片等信息。与查阅的文献相结合，得到物质的分子质量及初步结构信息。

HSCCC条件：溶剂体系：甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸体系；柱转速：800～1200r/min；流速：1.0mL/min；室温：28℃；紫外检测波长：280nm。

2 结果与分析

2.1 研制的圆盘嵌入式螺旋管色谱仪的分离柱

图1 圆盘嵌入式螺旋管色谱柱Auto CAD设计图Fig.1 Auto CAD design of spiral tube column

由图1可知，样机由2个串联的色谱柱所构成柱体积为30mL的分离柱，分别对称设置在J型高速逆流色谱行星架的两边，如图2所示，公转半径(R)70mm。根据柱体的设计计算，该逆流色谱仪的β值范围为0.3～0.7。主机的转速范围为800～1200r/min，无极变频控制。分离柱的转动由三相异步交流电动机带动，转速由变频器控制，电机允许最高转速为2500r/min。逆流色谱分离系统管路全部采用PTFE管(D0.8mm)，进样装置通过2个六通阀(V541)的交错连接实现定量环的切换和分离柱管路流向的切换。

图2 圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱内部结构图(俯视图)Fig.2 Vertical view of type J coil planet centrifuge equipped with a spiral tube column

将该圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱与一台传统多层缠绕的高速逆流色谱仪进行对比。为寻找合适的对比对象，将原北京市新技术应用研究所研制的一台小型高速逆流色谱仪的柱体进行改造即重新缠绕管路，保证二者所用管路与β值相同，其柱体积改为35mL；其余参数对比如表1所示，虽然公转半径(R)不同，但在后续实验时可以通过调整转速(ω)以保证二者可以在相同的离心力(g-levels)下工作，如表2所示，得到可信的对比数据，其中g-levels的计算如式(2)所示。

表1 圆盘嵌入式螺旋管HSCCC与传统HSCCC基本参数对比Table 1 Fundamental parameters of traditional HSCCC and spiral tube HSCCC

表2 传统多层缠绕HSCCC与圆盘嵌入式螺旋管HSCCC转速与对照表Table 2 Revolution speeds and g-levels of traditional HSCCC andspiral tube HSCCC

2.2 两台HSCCC在不同溶剂体系下保留能力对比

按照表2所示的传统多层缠绕HSCCC与圆盘嵌入式螺旋管HSCCC转速与g-levels的对照表调节转速进行对比实验。选取上述4种体系在圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪上的最佳洗脱模式，以相同流速在传统多层缠绕高速逆流色谱仪上进行对比实验，结果如图3所示。圆盘嵌入式螺旋管HSCCC在4种溶剂体系最佳洗脱模式不同g-levels的固定相保留率均比传统HSCCC高。前者与后者的主要区别在于螺距由1.6mm提高到11.6mm，其Sf有显著的提高。在L-I-T洗脱模式下，当流速为1mL/min时，传统多层缠绕色谱柱和圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪在正庚烷-甲醇体系中的固定相保留率(Sf)分别为50%和60%，在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系中的Sf值分别为60%和68%。在U-O-H洗脱模式下，流速为0.5mL/min时，传统多层缠绕色谱柱和圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪在正丁醇-醋酸-水体系中的Sf值分别为22%和60%；在L-I-T洗脱模式下，流速为0.5mL/min时两种色谱柱在聚乙二醇1000-磷酸钾盐-水双水相体系中的Sf值分别为15%和46%。

图3 两台HSCCC在不同溶剂体系中不同g-levels对固定相保留率的影响Fig.3 Effect of various g-levels on Sf of HSCCC in various solvent systems

2.3 转速对两台HSCCC保留能力的分析

图4 在不同体系下Sf对(1/g-levels)1/2回归分析Fig.4 Regression analysis between Sf and(1/g-levels)1/2 in various solvent systems

对不同溶剂体系下两台高速逆流色谱仪Sf对(1/g-levels)做回归分析，如图4所示。则：各个体系下Sf对(1/g-levels)1/2均成一定的线性关系，即符合Sf＝a－b(1/g-levels)1/2，与文献报道的Wood[15]、Berthod[16]等的公式相一致。该回归分析只考察了Sf稳定之前的数据，即例如聚乙二醇1000-磷酸盐-水体系下圆盘嵌入式螺旋管HSCCC的保留率在g-levels为78.25g、112.67g、153.38g时均达到了46.67%，因此只考察78.25g之前的数据。采用此方法的原因是在实验过程中发现，当转速达到一定值之后，随着转速的不断提高，其固定相保留率Sf并没有再随转速的提高而提高，而是趋于稳定。

2.4 圆盘嵌入式螺旋管HSCCC对黑果枸杞花青素样品的分离

2.4.1 黑果枸杞色素提取物HPLC检测和HPLC-MS检测

图5 黑果枸杞色素提取物HPLC色谱图Fig.5 HPLC analysis of Lycium ruthenicum Murr. extract

首先通过HPLC检测黑果枸杞色素提取物如图5所示，确认目标物质。由于花青素在525nm波长处有特征吸收，因此选取在525nm波长处吸收最强峰(61min物质)为目标物质进行分离。通过HPLC-MS检测其分子质量和分子碎片信息，可推断该物质如图6所示。其他在280nm检测波长处基本都可以检测到，因此后续实验以280nm进行检测分析。

图6 黑果枸杞色素提取物中主要花青素HPLC-MS质谱图Fig.6 HPLC-MS analysis of predominant anthocyanins in Lycium ruthenicum Murr. extract

2.4.2 黑果枸杞色素提取物的HSCCC的分离

在流速为1mL/min时，考察圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪对甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(1:2.5:1.5:5:0.001)体系保留能力，如图7所示。该体系的保留率变化规律为在L-I-T、U-O-H、L-I-H和U-O-T 4个模式下得到相对较高的固定相保留率，最佳洗脱模式为L-I-H与U-O-H，1200r/min(g-levels＝112.67g)保留率均达到40%。在传统多层缠绕HSCCC采用L-I-H洗脱模式，流速1mL/min，1600r/min(g-levels＝143g)时，此体系Sf仅为10%。因此，使用圆盘嵌入式螺旋管高速逆流色谱仪进行分离时，选取L-I-H的洗脱模式，流速1mL/min，转速为1200r/min。

图7 甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸体系不同洗脱模式下固定相保留率随g-levels的变化Fig.7 Sf changes with g-levels in methyl tert-butyl ether:n-butanol:acetonitrile:water: trifluoroacetic acid system under different elution modes

经过不断调整体系中甲基叔丁基醚、正丁醇和乙腈的比例，以期得到最佳的分离效果，如图8所示为调整后体系为甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(体积比2.5:1.5:1:5:0.001)的最佳分离效果图，其固定相Sf为67%；图9为HPLC检测图8中各个组分在280nm波长处的色谱图。可以明显看到洗脱出4个组分，主要成分集中在2号，组分纯度为89%。

图8 甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸体系(2.5:1.5:1:5:0.001)分离黑果枸杞花青素Fig.8 Separation of anthocyanins from Lycium ruthenicum Murr.extract using methyl tert-butyl ether:n-butanol:acetonitrile:water:trifluoroacetic acid system system

图9 甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸体系分离的黑枸杞花色素组分1～5的280nm波长处HPLC色谱图Fig.9 HPLC analysis of five separated anthocyanin fractions

3 结 论

由于实验条件的限制，螺距只有1.6mm和11.6mm两个参考数值，但是从实验结果分析，由于改变螺距，使HSCCC对溶剂的保留率得到了极大的改善和提高，并且成功应用于黑果枸杞花青素样品的分离，这在传统多层缠绕HSCCC上是无法实现的。在实验过程中基本选定溶剂体系的情况下，在仪器运行参数粗选的基础上进行色谱柱转速、流动相流量等运行参数的优化。由于转速达到一定值后，固定相保留率趋于恒定值，而且转速越高，越易产生乳化现象，因此实验过程应该采用适当的转速，盲目的提高转速，以降低仪器的使用寿命为代价而换取更高的Sf不可取。在HSCCC的柱体上进行优化设计，为提高HSCCC的固定相保留率提供了一种有效的途径，证明通过改变柱体的设计来增加Sf行之有效；在选取体系为甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸(体积比2.5:1.5:1:5:0.001)的情况下分离得到了纯度为89%的黑果枸杞花青素样品。

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Spiral Tube High-Speed Counter-Current Chromatography and Its Application in Separation of Anthocyanins fromLycium ruthenicumMurr.

PEI Hai-run，CAO Xue-li*
(School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

A type-J coil planet centrifuge with a 7.0 cm revolution radius was designed through the tandem connection of two spiral tubes. Theβvalue was in the range of 0.3－0.7. The total column capacity was 30 mL. Different polarity solvent systems such asn-heptane:methanol,n-hexane:ethyl acetate:methanol:water,n-butanol:acetic acid:water and PEG 1000:K2HPO4:water were used to comparatively study the retention capacities of the new HSCCC and the traditional multilayer coil HSCCC. The stationary phase retention factor (Sf) of the traditional multilayer coil HSCCC was 50% inn-heptane:methanol system and 60%inn-hexane:ethyl acetate:methanol:water system at a flow rate of 1 mL/min under the L-I-T elution mode, while for the spiral tube HSCCC, theSf values were 60% and 68%, respectively. TheSf values of the traditional multilayer coil HSCCC and the spiral tube HSCCC were 22% and 60% inn-butanol:acetic acid:water system at a flow rate of 0.5 mL/min under the U-O-H elution mode and 15% and 46% in PEG 1000:K2HPO4:water system at the same flow rate under the L-I-T elution mode, respectively. An excellent linear relationship betweenSf and (1/g-levels)1/2was achieved using each investigated solvent system. The new HSCCC was applied to separate anthocyanins fromLycium ruthenicumMurr. using a highly polar system composed of methyl tert-butyl ether,n-butanol, acetonitrile, water and trifluoroacetic acid (2.5:1.5:1:5:0.001), and the results showed that anthocyanins with a purity of 89% were obtained at a flow rate of 1 mL/min.

high-speed counter-current chromatography；spiral tube column；aqueous two-phase system；anthocyanins

TS207.3

A

1002-6630(2012)11-0001-07

2011-08-17

国家自然科学基金项目(20877005)

裴海闰(1984—)，男，硕士，研究方向为生物分离技术。E-mail：peihairun@th.btbu.edu.cn

*通信作者：曹学丽(1967—)，女，教授，博士，研究方向为生物分离技术。E-mail：caoxl@th.btbu.edu.cn