青岛地区兔肺炎克雷伯氏菌分离鉴定

王召朋 柴同杰 牟特 吕长辉



青岛地区兔肺炎克雷伯氏菌分离鉴定

王召朋①柴同杰②*牟特①吕长辉②

（①青岛康大外贸集团公司 胶南 266400 ②山东农业大学动物科技学院）

对青岛地区某兔场病死兔的病变器官组织进行细菌分离和纯培养，对所分离的细菌进行形态特征、理化性质和16SrRNA序列的分子鉴定和测序，人工感染以及药敏试验，判定为肺炎克雷伯氏菌。代表菌株16SrRNA序列长度1414bp，与GeneBank登录号为EU360123.1的肺炎克雷伯氏菌16SrRNA序列同源性100%，人工感染小鼠24h全部死亡，对供试的诺氟沙星等药物高度敏感，对供试的强力霉素等中毒敏感，对头孢拉定等耐药。应用筛选的敏感药物，并采取综合防治措施，使疫情得到了有效控制。

肉兔 肺炎克雷伯氏菌 分离 药敏试验

肺炎克雷伯氏菌属肠杆菌科克雷伯氏属，是一种常见的条件性致病菌，广泛分布于动物的消化道以及水、土壤和谷物中，可引起人畜发生肺炎、腹膜炎、子宫炎以及腹泻，甚至发生败血症。近年来现代养殖业生产方式得到迅猛发展，但由于养殖户的管理水平、养殖场的硬软件设施跟不上规模扩大的需要等原因，已经有多起有该菌引起的家畜感染的报道。

青岛某兔场在入冬后，部分母兔及仔兔发生腹泻病死亡，临床症状主要表现为腹胀，轻度腹泻，粪便呈深褐色水样，病例解剖发现盲肠、小肠浆膜充血出血，充满气体，肠内为深褐色或红褐色水样内容物，使用庆大霉素、安普霉素等抗生素治疗无效，且发病率和死亡率升高。为有效控制该病，对病死兔进行了剖检采样和病原分离鉴定，并进行了动物实验和药敏试验，筛选出有效药物，及时进行防治。

1 材料和方法

1.1 试剂 DHL琼脂、营养琼脂、脱纤维羊血、麦康凯琼脂、普通肉汤和生化鉴定管购自北京陆桥技术有限责任公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR预混料购自天根生化科技有限公司；Marker2000购自Taraka公司；DNA回收试剂盒购自OMEGA公司。

1.2 病原分离培养 取病死兔病变组织，无菌操作划线接种DHL琼脂平皿、血琼脂平皿、营养琼脂平皿和麦康凯琼脂平皿，至37℃温箱培养18~24h，观察结果。

1.3 染色及显微观察 将分离培养出的可以菌进行革兰氏染色，显微镜观察菌体形态。

1.4 生化试验 可疑菌普通肉汤纯培养物进行三糖铁、V-P、硝酸盐还原、M.R、西蒙氏柠檬酸盐、丙二酸盐、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、葡萄糖、乳糖、靛基质、半固体动力生化试验。

1.5 动物试验 试验用小白鼠8只，分试验组和对照组，每组4只。将可疑菌普通肉汤培养物试验组每只腹腔注射0.1ml，对照组每只腹腔注射生理盐水作为对照，饲养观察。对发病及死亡小鼠进行解剖和病原菌分离培养。

1.6 分子生物学鉴定 用细菌基因组DNA提取试剂盒提取的DNA作为模板，引物采用16SrRNA通用引物，上、下游引物序列分别为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，由上海生物工程公司和成。PCR反应体系25µl：1.0ml的模版DNA，10×PCR buffer (Mg2+free)2.5ml，MgCl2(2.5mmol/L)2ml，dNTP(2.5mmol/L)1.3ml，上下游引物(25µmol/L)各1ml，Taq DNA聚合酶(5U/µl)0.2µl；最后用灭菌双蒸水补足到25ml。PCR基本反应程序为94℃5min、94℃1min、55℃ 1min、72℃70s，共进行32个循环，最后于72℃延伸7min。PCR产物经10g/L琼脂糖电泳后，按OGEMA凝胶回收试剂盒回收目的片段，送上海生物工程公司测序。

1.7 药敏试验 取普通肉汤24h纯培养物1ml均匀涂布于营养琼脂平皿上，贴上药敏纸片，置于37℃温箱培养24h后观察试验结果。

2 结果

2.1 病原分离培养结果 在不同培养基上均长出了较大的粘液状菌落，相邻菌落易融合成浓汁样，接种针挑取时可拉出丝。在DHL琼脂平皿上菌落淡粉色、大而隆起、光滑湿润；在麦康凯琼脂平皿上菌落呈红色；在营养琼脂平皿上菌落乳白色、大而隆起，光滑湿润；在血琼脂平皿上不溶血。

2.2 染色镜检结果 革兰氏染色阴性，短杆菌，单个或成双排列，有荚膜，无芽孢。

2.3 生化试验结果 三糖铁37℃温箱培养24h，斜面产酸，底层产酸产气，硫化氢阴性。其他理化性质见表1。

表1 生化试验结果

2.4 动物试验结果 普通肉汤培养物接种小鼠后，试验组4只小鼠24h内全部死亡，对照组小鼠全部健活。死亡小鼠肺脏、肝脏细菌分离培养后染色镜检，得到与接种细菌相同的菌株。

2.5 分子鉴定结果 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳结果(图1)。

图1 PCR鉴定结果

(M: DL5000，0:阴性对照，1-3：待测菌株)

测序后经BLAST分析测序结果表明：该菌株16SrRNA与肺炎克雷伯氏菌(GeneBank中的序列注册号EU360123.1)的同源性最高，达100%。

2.6 药敏试验结果 药敏结果判定依据为《抗菌药物药敏纸片判断标准》。此次分离出的肺炎克雷伯氏菌对诺氟沙星等药物高度敏感，对强力霉素等中度敏感，对头孢拉定等耐药，具体结果见表2。

表2 药敏试验结果 (mm)

3 讨论

从本次发病临床症状、病理变化、镜检观察和生化特性分析，与肺炎克雷伯菌高度相似，通过分子生物学鉴定，结果表明病原菌与肺炎克雷伯氏菌同源性达到100%，从而证明了该菌即为肺炎克雷伯氏菌。通过染色镜检、生化鉴定等常规检测方式与分子生物学鉴定的对比，分子生物学鉴定准确性最高，操作简便快捷。

肺炎克雷伯氏菌作为家兔体内常在菌群，易引起家兔呼吸和消化系统疾病，且多为散发性病例，而像本次较大规模发病，引起断奶前仔兔大量腹泻死亡的病例报道较少。此次除肺炎克雷伯氏菌外，还分离到了致病性大肠杆菌，发病初期临场症状与大肠杆菌病较接近，但用药后病情没有改善，发病率和死亡率升高，临床症状也发生变化，加大用药量也无明显改善。说明此次肺炎克雷伯氏菌发病是由于气候变化、仔兔体质较弱及其他疾病等因素引起的，同时因该菌具有较强的耐药性，用药后仔兔肠道内菌群失调，也是爆本发病的一个主要原因。

肺炎克雷伯氏菌可以产生各种使抗生素失活的酶，这是造成该菌具有耐药性的原因，而且临床分离的菌株大多为多重耐药性菌株，给生产中防治该病造成了很大的困难，同时对养殖人员的健康也构成了一定的威胁。因其耐药的特性，预防成为了防治该病的主要手段，增强家兔免疫力，减小或避免各种应激，减少抗生素的滥用，都有利于预防该病的发生。一旦发生本病，早期诊断和有效药物的及时使用，是治疗本病的主要方法。针对此次肺炎克雷伯氏菌病，除使用有效抗生素外，还配合使用了肠道微生态制剂，提高体质和免疫力，使病情很快得到了控制。

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（2012–03–08）

通讯作者

S852.61+2

A

1007-1733(2012)05-0016-03