间接荧光法测定水产品中L-谷胱甘肽的含量

潘煜辰，陈舜胜，*，宋 青，赵善贞

（1.上海海洋大学，上海 201306；2.上海出入境检验检疫局，上海 200135）

间接荧光法测定水产品中L-谷胱甘肽的含量

潘煜辰1，陈舜胜1，*，宋 青2，赵善贞2

（1.上海海洋大学，上海 201306；2.上海出入境检验检疫局，上海 200135）

建立了间接荧光法测定水产品中L-谷胱甘肽（GSH）含量的方法。样品经三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白，调上清液pH至10.5同时二次沉淀蛋白，提取液稀释一定倍数后以邻苯二甲醛（OPA）为荧光衍生剂，等体积（1∶1，v∶v）暗处混合反应1～2min，在Ex 325nm和Em 400nm条件下测得总荧光值A。同时以N-乙基马来酰亚胺（NEM）屏蔽待测液中含巯基的化合物，测得杂质产生的荧光值B，以总荧光值A减去荧光值B，得出GSH所产生的荧光值，间接测得GSH含量。在0.125～1.250mg/L浓度范围内GSH线性关系良好，R2=0.9963，回归方程为Y=57.012X。该方法的相对标准偏差（RSD）为3.83%～5.25%，平均回收率为91.37%～102.20%。改进后的方法弥补了荧光法本身特异性不高的缺点，使得测定更精确，适用于水产品中L-谷胱甘肽含量的测定。

L-谷胱甘肽，间接荧光校正法，牡蛎，蚝油

L-谷胱甘肽（GSH），又称还原型谷胱甘肽，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物，是一种用途广泛的活性短肽，广泛存在于动植物中，在酵母、胚芽和动物肝脏中的含量极高[1]。目前，L-谷胱甘肽的主要检测方法[2-3]有酶循环法、电化学法、荧光法和高效液相色谱法（HPLC）等。其中，酶循环法[4]虽然廉价，但如果待测体系中存在氧化型谷胱甘肽（GSSG），则该方法测得的是总谷胱甘肽的量，无法单独测定GSH的含量；电化学法[5-6]的灵敏度很高，是唯一一种不需要对GSH进行衍生化就可测得其含量的方法，但是很多电极在长时间使用后，其表面被氧化，稳定性和灵敏度都会下降，而且多数电极的价格相当昂贵；HPLC法[7-9]具有良好的分离能力，但样品的前处理复杂耗时，所用的柱也较为特殊，且流动相多采用磷酸盐缓冲液，有的还添加离子对试剂三氟乙酸（TFA），对柱子损害较大、不易保护[1]。有人用荧光法检测了海藻[10]、大豆[11]、对虾等海洋生物[12]、黄瓜[13]中的GSH，还有研究者采用荧光增强剂[14-15]来加强荧光信号。然而，荧光法虽然快速简便，但其本身存在特异性不高的缺点，含有巯基的化合物（如半胱氨酸）或杂质会干扰测量[16]等。因此，本实验对荧光法测定水产品中L-谷胱甘肽含量的方法进行了改进。改进后的荧光法保持了原有快速简便，衍生1～2m in即可测定，且具有能保持30m in左右的稳定性，灵敏度也较高等优点，同时也排除了半胱氨酸和其他杂质的干扰，弥补了其特异性不高的缺点，提高了测定的准确度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

太平洋牡蛎，珠江牡蛎，太平洋蚝水（汁），珠江蚝水（汁），市售蚝油；邻苯二甲醛（OPA）、磷酸氢二钠、三氯乙酸（TCA） 日本和光纯；氢氧化钠 国药集团；N-乙基马来酰亚胺（NEM）、谷胱甘肽（GSH）标准品 Sigma公司。

RF-1501荧光分光光度计 日本岛津；离心机无锡瑞江分析仪器；分析天平、pH计 梅特勒-托利多公司。

1.2 样品前处理

称取已捣碎的牡蛎、蚝水、蚝汁和蚝油各10g，分别加入10%TCA溶液各10m L，混匀并倒入离心管，加一定量的蒸馏水，高速离心10min（5000r/min），倒出上清液，加水至90m L左右，用NaOH调pH至10.5同时二次沉淀蛋白，分2个50m L离心管再次离心10min（5000r/m in），合并上清液，加少量蒸馏水定容至100m L，作为提取液。

对于蚝水、蚝汁和蚝油提取液：移取2份各1m L提取液，其中一份直接定容至100m L，作为待测液；另一份先加入1m L浓度为0.5%的NEM溶液，再定容至100m L（定容过程的最后需将pH调至10.5），作为空白液。

对于牡蛎提取液：移取2份各5m L牡蛎提取液，其中一份直接定容至50m L，作为待测液；另一份先加入1m L浓度为0.5%的NEM溶液，再定容至50m L（定容过程的最后需将pH调至10.5），作为空白液。

1.3 定量分析

将样品待测液、空白液分别与OPA按照1∶1的比例混合，摇匀，暗处反应1～2min，转移至比色皿中，放入荧光分光光度计，在激发波长325nm和发射波长400nm条件下测定荧光值A和B，以A与B的差值作为GSH所发出的荧光强度，从而定量。

1.4 GSH标准系列溶液的配制

GSH标准系列溶液：精确称取谷胱甘肽标准品10.0mg，用pH为10.5的磷酸氢二钠缓冲液定容至100m L，即为100mg/L的GSH储备液，再分别吸取一定量的储备液于50m L容量瓶中，用缓冲液定容得0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.250mg/L 5个梯度的标准系列溶液。

2 结果与分析

2.1 半胱氨酸对测定的影响及荧光波长的选择

以1.4中所配制的GSH标准液，在荧光光度计上扫描200～500nm波长范围，得最大激发波长Ex为346nm，最大发射波长Em为420nm。

半胱氨酸（Cys）是20种基本氨基酸中唯一一种含有巯基（-SH）的氨基酸，而OPA与GSH的结合位点正为巯基，所以半胱氨酸的存在可能会对GSH的定量产生影响，使其测定值偏高，导致假阳性结果。

分别吸取浓度均为100mg/L的GSH和Cys储备液0.5m L置于2个容量瓶中，以磷酸缓冲液定容至50m L，分别形成1mg/L的GSH和Cys标准溶液；再吸取2种储备液各0.5m L，混合于同一容量瓶，用磷酸缓冲液定容至50m L，形成浓度为1mg/L的混合标准液。对三种待测液同时在上述荧光波长下进行荧光值的测定。

结果表明，1mg/L的谷胱甘肽和半胱氨酸与OPA结合后所产生的荧光强度之和与1mg/L的两者混合标准溶液所产生的荧光强度相近（见表1），说明若待测液中含有半胱氨酸，则会对谷胱甘肽的定量测定产生影响，所以实验中需要调整测定时的激发波长和发射波长，以使得在某一特定条件下，半胱氨酸的荧光强度为0，而谷胱甘肽的荧光强度较大，以提高测定的准确度。

表1 Cys对GSH检测的干扰Table 1 Cys’s interference to determination of GSH

配制一定浓度的半胱氨酸标准溶液，同样在荧光光度计上扫描200～500nm波长范围，得半胱氨酸的最大激发波长Ex为335nm，最大发射波长Em为455nm。然后，经多次对波长进行调整后，确定了实验中的荧光条件为Ex：325nm和Em：400nm，此时半胱氨酸的荧光强度刚好为0，对实验不会产生干扰，而谷胱甘肽的荧光强度降低为56.74。

2.2 标准曲线及线性相关系数

按照1.3的方法，以质量浓度为横坐标，荧光强度（FI）为纵坐标，在确定的荧光波长下对谷胱甘肽标准系列溶液进行荧光值的测定：在0.125～1.250mg/L浓度范围内，谷胱甘肽具有较好的线性关系，相关系数R2为0.9963，回归方程为Y=57.012X。

2.3 溶液体系的pH对测定的影响

分别吸取0.5m L浓度为100mg/L的谷胱甘肽储备液置于9个容量瓶中，加约40m L蒸馏水，用一定浓度的NaOH溶液将其pH分别调至8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5和12.0，再加少量蒸馏水定容至50m L（忽略pH的变化），最终形成9种不同pH、浓度均为1mg/L的GSH标准溶液，测定其荧光强度，结果见图1。

图1 1mg/LGSH溶液在不同pH体系中的荧光强度Fig.1 The fluorescence intensity of 1mg/LGSH at different pH

由图1可见，当溶液的pH为10.5时，由于GSH和OPA的结合程度最大，结合的稳定性也最好，因而体系所产生的荧光强度最强，荧光值为56.72，所以实验确定10.5为测定谷胱甘肽含量的最佳pH。

2.4 杂质干扰的消除

N-乙基马来酰亚胺（NEM）能与蛋白质、氨基酸中的巯基结合发生不可逆反应，因此在本研究中采用NEM作为巯基掩蔽剂来阻止GSH与OPA进行结合，从而可测得其他杂质与OPA结合后所产生的荧光强度，进而消除杂质所带来的影响。

在1.00mg/L GSH标准溶液里加入1m L浓度为0.5%的NEM溶液，按照1.3的方法进行荧光强度的测定，结果表明，未加掩蔽剂前GSH标准品的荧光强度为61.72（表1），而加入NEM后所产生的荧光强度仅为0.64，足足降低至约原来的1/100，说明NEM具有良好的掩蔽作用，可用于在本实验中屏蔽GSH含有的巯基。

2.5 精密度及回收率

2.5.1 精密度测定 准确称取7份太平洋牡蛎各10.0g，按照1.2和1.3的方法以及参照2.2的标准曲线，对样品待测液中的GSH浓度进行测定，平行7次，并计算RSD，结果见表2。

表2 精密度测定结果（n=7）Table 2 Precision of themethod（n=7）

2.5.2 回收率实验 根据表2的测定结果可推得，太平洋牡蛎中GSH的含量约为0.0182mg/g，因此样品的加标量选为0.1、0.2、0.3mg，即在样品中分别加入10m L浓度为10、20、30mg/L的GSH标准溶液，对每一加标浓度，均进行5次平行实验，并计算RSD。

加标回收率（%）=（加标测定值-样品测定值）/加标量×100；结果见表3。

表3 加标回收试验（n=5）Table 3 Recovery and relative standard deviation of themethod（n=5）

2.6 7种水产品中GSH含量的测定

依据1.2和1.3的方法，对7种水产品中的GSH含量进行了测定，结果如表4所示，GSH在牡蛎中的含量在15～18.5mg/kg；在蚝水和蚝汁中则高达255～ 322mg/kg，约为牡蛎中的17倍；在市售蚝油中的含量为149mg/kg，约为蚝水、蚝汁的1/2。这是由于蚝水和蚝汁是对牡蛎通过加热的方式进行处理后的浓缩液，而市售蚝油则是在上市之前通过对蚝水和蚝汁进行稀释并添加其他作料而制成的成品。所以，GSH在这3类样品中的含量顺序为：蚝水和蚝汁＞蚝油＞牡蛎。

表4 7种水产品中GSH的含量（mg/kg）Table 4 The content of GSH in 7marine products（mg/kg）

3 结论

采用间接荧光法，以OPA为衍生剂，实验中调整了荧光法测定时的激发波长和发射波长，以消除半胱氨酸对谷胱甘肽测定的干扰。其次确定了10.5为测定谷胱甘肽含量的最佳pH，在测得样品中总荧光强度的基础上，以NEM掩蔽了GSH以得出杂质的干扰值，并予以排除，进而间接测得GSH的含量，实验最后对7种水产品中的谷胱甘肽含量进行了定量，获得满意的结果。该方法弥补了荧光法本身特异性不高的缺点，同时又保留了其快速、灵敏度高等诸多优点，提高了测量的精准度，适用于水产食品中L-谷胱甘肽含量的测定。

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Determ ination of L-glutathione in marine products by the method of indirect fluorescence

PAN Yu-chen1，CHEN Shun-sheng1，*，SONG Qing2，ZHAO Shan-zhen2
（1.ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China；
2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai200135，China）

The method of ind irect fluorescence was developed to the determ ination of L-g lutathione（GSH）in marine p roducts.The p rotein in p roducts was p recip itated by TCA，then the pH of supernatantwas ad justed to 10.5，during which the p rotein was p recipitated again.OPA was used as derivatization agent to be m ixed w ith extraction liquid（1∶1，v∶v），which had been diluted，and then total fluorescence intensity（FIA）was determ ined at Ex 325nm and Em 400nm after reacting for 1～2m in in the dark.Meanwhile，FIB em itted by impurity was determ ined after using NEM to screen all the compounds with sulfyd ryl.FI em itted by GSH was known by deduc ting FIB from FIA，then GSH was determ ined ind irectly.Its fluorescence intensity was linear to GSH concentration in the range of 0.125～1.250mg/L，R2=0.9963，reg ression equation was Y=57.012X.The GSH in three sam p les was determ ined w ith RSD ranged from 3.83%～5.25%as well as average recovery ranged from 91.37%～102.20%.The poor specificity of fluorescence method was made up by the method of ind irec t fluorescence w ith higher p recision which could be app lied to the determ ination of GSH in marine p roducts.

L-g lutathione；correction method of indirect fluorescence；oyster；oyster sauce

TS207.3

A

1002-0306（2012）20-0070-04

2012－07－14 *通讯联系人

潘煜辰（1987-），男，硕士研究生，研究方向：食品检测与分析。

国家科技支撑计划课题（2006BAD05A18）；上海检验检疫局课题（HK067-2011）。