柱前DPPH- HPLC-DAD-MS联用快速鉴定紫薯中的抗氧化花色苷

傅茂润，何志平，赵 双，刘玉芹，刘秀河，王 晓

(1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353;2.浙江农林大学食品学院，浙江临安311300; 3.山东阿如拉医药发展有限公司，山东济南250100;4.山东省科学院山东省分析测试中心，山东济南 250001)

柱前DPPH- HPLC-DAD-MS联用快速鉴定紫薯中的抗氧化花色苷

傅茂润1，何志平2，赵 双1，刘玉芹3，刘秀河1，王 晓4，*

(1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353;2.浙江农林大学食品学院，浙江临安311300; 3.山东阿如拉医药发展有限公司，山东济南250100;4.山东省科学院山东省分析测试中心，山东济南 250001)

为建立一种能够快速、准确的鉴别并比较具有抗氧化活性的花色苷的方法，以紫薯为研究对象，采用DPPH自由基柱前衍生化与HPLC联用技术分析具有抗氧化活性的花色苷物质特征峰，然后采用液质联用技术进行结构鉴定，从紫薯中鉴定出6种花色苷，由于结构的不同，6种花色苷的抗氧化活性有较大的差异，其中飞燕草－3，5－双葡萄糖苷的抗氧化能力最强，其它的相对较弱。该方法的建立，有助于实现花色苷类物质抗氧化活性的快速比较和鉴定，揭示其构效关系提供理论和技术支持。

抗氧化活性，花色苷，柱前衍生化反应，紫薯

花色苷具有很强的抗氧化能力［1］，可有效清除脂类自由基，切断脂类氧化的链式反应，起到防止脂质过氧化的作用［2］，因此，对颜色较深果蔬及花卉的抗氧化活性及作用机制研究已成为近年来的热点，如蓝莓、黑豆、紫甘薯、杨梅、桑椹等［3－7］。目前学者们对花色苷的分析手段大多停留在总花色苷的提取与测定阶段，对起抗氧化作用的具体花色苷单体及它们的活性差异尚无法准确分析和比较，这已成为花色苷研究中的一个难点。在花色苷活性物质分离、纯化和鉴定过程中，一般都遵循植物化学研究的模式，即首先应用各种分离手段对化学成分进行系统分离与结构鉴定，再对得到的单体成分进行活性测试［8］。应用这种方法，很多食品活性成分得以阐明，但仍存在一些问题，包括目标不明确、操作繁琐、工作量大、周期长、活性成分在分离过程中易丢失;自身结构极不稳定，花色苷在分离和纯化过程中经常会变化或分解，导致含量减少或性质改变;食品及其制品是个复杂的体系，种类及种间的酸性、糖度、维生素、蛋白质、脂肪、物性等个体差异很大，环境、成熟度、采后加工方式等影响因素较多。以上的原因都会造成抗氧化活性的差异，也为抗氧化活性花色苷的定性和定量带来了很大困难，只有搞清楚食品中天然的花色苷，才有可能对其降解机制和活性进行有效、准确的研究。因此很有必要建立一种能够快速、准确的分析鉴别具有抗氧化活性的花色苷的方法。本文以紫薯为研究对象，采用自由基柱前衍生化反应与HPLC联用技术分析具有抗氧化活性的花色苷物质特征峰，然后采用质谱联用技术对其进行结构鉴定，从而建立一种有别于传统分离－纯化－鉴定有效物质的快速、简单的新方法。该方法的建立，有助于实现花色苷物质的快速鉴定，从而为探知食品和花卉中天然的花色苷物质，揭示其构效关系提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫薯 购自山东省济南市千佛山农贸市场;盐酸、甲醇、乙酸乙酯 分析纯，天津广成化学试剂有限公司;乙腈 色谱纯，山东禹王实业有限公司; DPPH自由基 美国Sigma公司。

KQ3200型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;SP－722E型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;Agilent 1100LC液相色谱仪、Agilent 6520四级杆－飞行时间串联液质联用仪(Q－TOF)美国Agilent公司;AUW220D电子分析天平 日本Shimadzu公司;BUCHI旋转蒸发仪 瑞士BUCHI公司等。

1.2 花色苷的提取

花色苷的提取参考Longo等的方法［9］略有改动。新鲜紫薯在4℃打浆，准确称取100.0g，加入300mL甲醇溶液(含0.1%盐酸)、室温下超声提取3次，每次20min。布氏漏斗真空抽滤，滤渣再用100mL甲醇溶液(含0.1%盐酸)重复提取两次，分别将3次滤液合并，45℃下真空浓缩去除甲醇，最后用水(含0.01%盐酸)定容至50mL，备用。

1.3 紫薯花色苷的净化处理

首先使用石油醚对紫薯花色苷粗提物进行萃取，去除提取物可能含有的脂溶性成分，然后采用乙酸乙酯萃取，去除提取物中存在的黄酮。选择XAD－7树脂对紫薯花色苷粗提物进行纯化，以利于进一步的分析。

1.4 紫薯花色苷的液相分析条件

Agilent TC－C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，二元梯度洗脱，流动相A为水(含0.4%甲酸)，B为乙腈。程序为:0min，90%A:10%B;0～5min，B相从10%升至17%;5～30min，B相保持17%不变;30～35min，B相从17%升至100%。进样10μL，流速1mL/min，柱温25℃，检测波长517nm。

1.5 花色苷的质谱分析条件

离子源API－ESI，正、负离子两种检测模式，四极杆温度100℃，雾化压力0.241MPa，碎裂电压175V，干燥气温度350℃，干燥气流量10L，毛细管电压4kV，碰撞能量20V，m/z扫描范围100～1700。

1.6 抗氧化活性的测定

将不同体积的紫薯花色苷提取液(相当于2g鲜重/mL的花色苷提取液)100、200、400、600、800μL分别加入4mL 0.04mg/mL DPPH自由基甲醇溶液中，

其中:At为加入提取液后的DPPH自由基的吸光值;A0为加入50%丙酮的DPPH自由基的吸光值。用50%丙酮定容至5mL，振荡摇匀，30min后用溶剂作参比，采用分光光度法在517nm处测定吸光度。

提取物清除DPPH·自由基能力的计算公式为:

1.7 花色苷单体抗氧化活性的筛选及比较

参考Tang等的方法［10］略有改动。分别取2份紫薯花色苷提取液1mL于10mL具塞试管中，加入3mL甲醇溶液和3mL 0.04mg/mL的DPPH甲醇溶液，摇匀，30min后同条件下进行HPLC测定。根据HPLC峰面积归一化法计算517nm下花色苷提取液中各花色苷的峰面积，计算消减率。根据消减率的大小，可比较得出各物质之间的抗氧化差异。

其中:A反应前为加入甲醇溶液的的峰面积值;A反应后为加入DPPH自由基甲醇溶液后的峰面积值。

2 结果与分析

2.1 紫薯花色苷物质的定性分析

2.1.1 紫薯花色苷的液相图谱 花色苷是类黄酮化合物，在可见光区和紫外区的最大吸收波长分别为500～540nm和275nm附近，可通过测定色素的最大吸收波长判断是否为花色苷类色素［11］。图1为紫薯花色苷提取物在517nm检测波长下的高效液相色谱图。6个色谱峰的紫外－可见光谱图见图2。由图2可知，这6个色谱峰在500～540nm和275nm处都有最大吸收，因此可以确定它们都是花色苷类化合物。

图1 紫薯花色苷提取物的高效液相色谱图(波长517nm)Fig.1 HPLC chromatogram of anthocyanins in purple sweet potato at 517nm

2.1.2 紫薯花色苷的HPLC－ESI/Q－TOF－MS/MS分析 按照上述的质谱条件，获得了紫薯中主要花色苷色谱峰的分子离子及二级碎片离子。根据正离子模式下色谱峰的一级质谱的分子离子和二级质谱离子碎片，获得化合物的准确分子量信息，分析每个谱峰，确定可能的分子量，并与文献报道的成分进行比较，从而推测出了色谱峰的组成(表1)。

由表1可以看出，紫薯中的六种花色苷分别为矢车菊－3－(阿魏酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷，飞燕草－3，5－双葡萄糖苷，飞燕草－3－接骨木二糖苷－5－葡萄糖苷，矮牵牛花－3－(p－香豆酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷，矮牵牛花－3－(阿魏酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷和锦葵－3－(p－香豆酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷，其中矮牵牛花－3－(p－香豆酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷的含量最为丰富。

表1 紫薯中主要花色苷的HPLC/MS数据Table 1 HPLC/MS data of the main anthocyanins from purple sweet potato

图2 6个色谱峰的紫外－可见吸收图谱Fig.2 UV－Vis spectra of peaks

2.2 紫薯花色苷的抗氧化能力

DPPH自由基是一种深紫色的稳定自由基，其甲醇溶液为紫色并在517nm附近有强的吸光值，当被抗氧化剂还原，或与另外一个自由基结合时，转化为无色的1，1－二苯基－2－三硝基苯胺，吸光值都会降低，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因此可用自由基的清除情况来评价某物质的抗氧化能力，其抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化能力越强。由图3可以看出，紫薯花色苷提取液对DPPH自由基具有较强的清除能力，半抑制浓度为0.475mg/mL。

图3 紫薯花色苷提取液的抗氧化能力Fig.3 Antioxidant activity of anthocyanins from purple sweet potato

2.3 紫薯花色苷组分抗氧化能力的比较

根据HPLC峰面积归一化法在517nm下花色苷提取液中各花色苷在DPPH自由基清除前后的峰面积，计算消减率。经过DPPH反应后，具有抗氧化能力的花色苷成分的峰面积将减小。消减率越大，花色苷成分的抗氧化能力越强，据此可实现果蔬中花色苷成分的抗氧化筛选与比较。

由图4和表2可以看出，紫薯中6个花色苷均具有一定的抗氧化能力。但与DPPH自由基反应后，花色苷的峰面积发生了显著不同程度的消减，消减率在3%～69%之间，说明各个花色苷组分之间的抗氧化能力存在着比较大的区别，其中飞燕草－3，5－双葡萄糖苷的抗氧化能力最强，消减率达到68%以上，矮牵牛花－3－(p－香豆酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷和矮牵牛花－3－(阿魏酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷差别不大，在13%～15%左右，而另外三种花色苷反应前后的消减率均低于6%。尽管矮牵牛花－3－(p－香豆酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷的含量超过花色苷总峰面积的80%，且对DPPH自由基的清除能力处在第二位，但仅为15.25%，远低于较低含量的飞燕草－3，5－双葡萄糖苷的68.57%。

表2 紫薯中主要花色苷的抗氧化能力比较Table 2 Comparison of antioxidant activity of main anthocyanins from purple sweet potato

图4 反应前后紫薯中花色苷的液相图谱Fig.4 HPLC chromatogram of anthocyanins in purple sweet potato before＆after reaction

3 讨论

3.1 花色苷类抗氧化活性物质的分析方法

目前，研究者评价植物花色苷组成往往只能通过测定总花色苷含量来进行评价，同时花色苷单体物质的获得非常困难，对起抗氧化作用的具体花色苷尚无法准确分析和鉴定，这已成为花色苷研究中的一个难点。目前，花色苷的鉴定方法包括纸层析法、水解分析法、紫外－可见光谱法、红外吸收光谱法、质谱法等。但这些方法在分析鉴定花色苷时也面临着分析测定不够准确，分析工作较为繁琐，分析周期长等缺点。

近年来，人们开始采用高效液相－质谱联用(HPLC－MS)技术来检测果蔬中的抗氧化物质［16］，但对于花色苷类物质的检测尚没有报道。另外还有一些在线HPLC检测植物提取物中抗氧化活性物质的方法报道，主要是基于在线检测抗氧化物质与自由基反应的柱前衍生化技术［17］，这些方法由于在线检测仪器设备的复杂性和难以商业化而无法得到推广。Shui等［18］研发了一种通过与自由基淬灭反应后利用液相色谱－质谱联用检测生物样品中的主要抗氧化黄酮类物质的方法，即首先将提取液与自由基进行反应，比较衍生与未衍生的液相色谱峰的差异，再根据其质谱信息确定抗氧化黄酮类物质，如ABTS－HPLC－DAD－MS联用［19］和DPPH－HPLC－DAD－MS联用技术［10］。这些方法为抗氧化活性花色苷的快速分析和鉴定指明了方向。本文为这项技术在花色苷的分析和鉴别中的应用做出了有益的尝试，从实验的结果可以看出，尽管矮牵牛花－3－(p－香豆酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷的含量超过总花色苷的80%，且对DPPH自由基的清除能力处在第二位，但仅为15.25%，远低于较低含量的飞燕草－3，5－双葡萄糖苷。在分离纯化抗氧化花色苷的过程中，低含量而高活性的花色苷容易被忽视，本方法的建立可从分离纯化工作的开始就避免此类问题的发生，有利于筛选和分离出最高活性的物质。这有助于实现抗氧化活性物质的快速鉴定和分析，也为其它生理活性的研究提供了思路，这对阐明食品加工中活性花色苷的降解过程及其机制，揭示生物活性与其结构的关系具有重要的意义。

3.2 花色苷抗氧化活性与结构的关系

天然产物的构效关系研究一直是食品科学领域的研究热点。一般认为，花色苷六大基本构成的抗氧化能力排序为:天竺葵色素＞矢车菊色素＞飞燕草色素＞芍药色素＞牵牛花色素＞锦葵色素，但酰基化、糖苷配基、甲基化、羟基数目以及半儿茶结构等均有很大的关系，比如，羟基数量越多，抗氧化性能越强;葡萄糖苷配基的数量多，抗氧化性能越强［20－21］;C3的配糖酰基化有可能会降低花色苷的抗氧化能力［22］。由图4和表2可看出，尽管紫薯花色苷组分均具有较强的抗氧化能力，但它们之间仍存在着巨大的差异，其中飞燕草－3，5－双葡萄糖苷的抗氧化能力最强，矮牵牛花－3－(p－香豆酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷和矮牵牛花－3－(阿魏酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷次之，而锦葵花色素的抗氧化能力最弱，这与上述的研究结果基本一致。

本方法的提出，可以实现花色苷抗氧化活性的快速鉴别，从而为进一步的分离和纯化活性强的化合物指明了方向，体现活性指导下的物质分离与纯化的技术思想，从而提高效率，减少消耗。

4 结论

采用柱前自由基衍生化反应，结合HPLC－MS技术，实现了紫薯中6种抗氧化花色苷物质的快速分离、鉴定和比较，发现飞燕草－3，5－双葡萄糖苷的抗氧化能力最强，矮牵牛花－3－(p－香豆酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷和矮牵牛花－3－(阿魏酰基)－双葡萄糖苷－5－葡萄糖苷次之，而锦葵花色素的抗氧化能力最弱。

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Rapid identification of antioxidant activity anthocyanins in purple sweet potato by pre－column DPPH free radical－high performance liquid chromatography－mass spectrometry

FU Mao－run1，HE Zhi－ping2，ZHAO Shuang1，LIU Yu－qin3，LIU Xiu－he1，WANG Xiao4，*
(1.College of Food Science and Bioengineering，Shandong Polytechnic University，Ji’nan 250353，China;
2.Department of Food Science，Zhejiang Forestry College，Lin’an 311300，China;
3.Shandong Arura Pharmceutical Research＆Development Co.，Ltd.，Ji’nan 250100，China;
4.Shandong Analyz and Test Center，Shandong Academy of Sciences，Ji’nan 250001，China)

To establish a new method which could analysis，identify and compare the antioxidant activity quickly and accurately，purple sweet potato as experimental material，combination of pre－column derivatization reaction with DPPH(1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl)free radical and HPLC－MS were used to analysis the characteristic peaks of anthocyanins in purple sweet potato with antioxidant activity，then，structure identification was done by HPLC－MS.Six anthocyanin compounds were identified in purple sweet potato and the relationship between structure and antioxidant activity was expanded that delphinidin－3，5－diglucoside was the strongest and other five compounds were more poor.Establishment of the method would help to identify anthocyanin compounds quickly，which provided theory and technical support for anthocyanin compounds to investigate their natural structure in food and flowers，and expand their structure－activity relationship.

antioxidant activity;anthocyanins;pre－column derivatization reaction;purple sweet potato

TS255.1

A

1002－0306(2012)21－0125－05

2012－04－11 *通讯联系人

傅茂润(1981－)，男，博士，副教授，研究方向:食品科学。

山东省大型仪器升级改造项目(2011SJGZ30);浙江省公益性项目(分析测试)(2011C37067)。