超声评价辛伐他汀的抗兔动脉粥样硬化作用及其机制的探讨

马娜 任俊红 任卫东 郭发金

心脑血管病是严重危害人类健康的常见病和多发病，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是其主要病理生理学基础。彩色多普勒超声检查是临床评价外周动脉粥样硬化的首选方法，腹主动脉位置表浅，走行平直，易于超声检查，并且AS发病率高，可反映全身动脉粥样硬化的程度。他汀类药物被认为是一类具有较强抗动脉粥样硬化作用的药物，除调脂作用外，还具有其他抗动脉粥样硬化的作用，仍是目前研究的热点。本研究应用高频超声观察辛伐他汀对兔腹主动脉AS病变的作用，同时定量测定动脉壁声学密度值变化，探讨超声评价AS的价值，并分析辛伐他汀降脂作用外，对增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)在AS斑块中表达的影响。

1 材料和方法

1.1 动物模型建立及分组

健康日本大耳白兔30只，雄雌不限，体质量2.0～2.5 kg，平均(2.21±0.26)kg。纯种普通级，3个月龄，许可证号:SYXK(辽)2003-0013。适应性喂养后，采用随机数字表法平均分为3组:健康对照组(A组)，喂以常规兔颗粒饲料;AS模型组(B组)，每日喂以高脂饲料(含l%胆固醇+2%蛋黄粉+5%猪油)100 g后自由摄食颗粒饲料;辛伐他汀(国药准字H19990366，杭州默沙东制药，中国)治疗组(C组)，喂以高脂饲料(同B组)4周后每日加喂辛伐他汀10 mg/kg。兔单笼饲养，自由饮水，喂养共16周。预实验中高脂饲料喂养4周测得血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇显著增高，8周截取腹主动脉光镜见早期AS病变，证实初步造模成功。

1.2 血脂水平测定

应用日立7060型全自动生化分析仪以酶比色法测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。

1.3 高频超声及声学密度定量检测

采用速眠新0.15 ml/kg及戊巴比妥1 ml肌注麻醉，将兔仰卧位四肢固定于检查床上，常规联接体表心电图，腹部备皮。应用HP Sonos 5500型超声诊断仪，高频探头频率7.5 MHz，取样深度4 cm，调节侧向增益补偿和时间增益补偿均置于0线，其他各项设置在实验过程中保持不变。自剑突下至髂总动脉分支处自上而下探查腹主动脉，观察动脉内膜是否光滑、有无增厚、斑块部位、大小和回声特点，彩色多普勒显示腹主动脉血流，观察有无湍流及狭窄，启动脉冲多普勒于腹主动脉管腔中央取样记录血流频谱。测量腹主动脉内膜-中层厚度(intimal medial thickness，IMT)、收缩期血流峰值速度(Vp)。声学密度定量分析:取样跟踪腹主动脉壁感兴趣节段内中膜及同一声束扫描线管腔、动脉壁外膜，记录背向散射积分参数值(单位:dB):管腔(AII-L)、增厚的内中膜(AII-I)、外膜平均回声强度(AII-A)及内中膜校正回声强度(AII:AII-I与AII-L的比值)。

1.4 病理形态学检查及PCNA、bFGF免疫组织化学分析

超声检查后剖腹截取腹主动脉，肉眼观察并留取标本作HE染色、弹力纤维染色及免疫组织化学染色。光镜下观察内膜有无泡沫细胞及斑块、内弹力膜完整性、平滑肌细胞及弹力纤维增生程度。SABC法免疫组化染色试剂盒，鼠抗兔PCNA单克隆抗体、兔抗兔bFGF抗体(购自武汉博士德生物工程公司)，按试剂盒说明操作，经Meta Morph Image System图像分析系统处理，观测内膜bFGF阳性产物平均光密度值、PCNA阳性表达率(即阳性细胞数占总细胞数的比率)。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 3组血脂水平比较

16周末A组血脂在正常范围，B、C组TC、TG、LDL-C显著增高，C组较B组减低，差异有统计学意义(均为P＜0.05)。见表1。

2.2 3组高频超声、声学密度检测与病理学结果比较

A组高频超声检测腹主动脉壁光滑，未见增厚，血流充盈良好，病理组织学未见明显病变。B组、C组声像图示动脉内中膜毛糙增厚，回声不均，B组并可见多处自内膜突入管腔的局限性低、中等回声，彩色血流边缘不规整，斑块部位血流充盈缺损，B组病理可见动脉内膜多层泡沫细胞隆起聚集、弥漫性增厚，表面薄层纤维帽形成，斑块内平滑肌细胞及弹力纤维增生明显，并见棒状胆固醇结晶裂隙，内弹力板扭曲、断裂。C组病理见散在脂纹、脂斑形成，弹力纤维染色见局部内弹力板改变(图1～4)。3组兔腹主动脉彩色多普勒显像未见狭窄改变。

A组动脉壁IMT值小，声像图呈线样，声学密度值无法测得。B组、C组IMT较A组显著增高，C组IMT、AII-I、AII值较B组明显减低，差异有统计学意义(均为 P＜0.05，表2)。

2.3 PCNA、bFGF阳性表达

免疫组织化学检测A组动脉基本无阳性表达，偶见内膜出现单个散在的阳性细胞。B、C组均可见棕黄色阳性表达，bFGF阳性表达主要存在于增生内膜及中膜层胞浆内，B、C组bFGF平均吸光度值分别为0.23±0.01、0.15±0.07;PCNA阳性表达位于胞核，B、C组阳性表达率分别为 39.38±2.71、20.25±3.05，C组PCNA及bFGF阳性表达较B组显著减低(均为 P ＜0.05，图5、6)。

表1 血脂水平比较()

表1 血脂水平比较()

注:与A组比较，aP＜0.05;与B组比较，bP＜0.05

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表2 腹主动脉IMT、Vp、声学密度值比较()

表2 腹主动脉IMT、Vp、声学密度值比较()

注:与B组比较，aP＜0.05;与A组比较，bP＜0.05

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图1 B组B超显示其AS斑块处彩色血流信号充盈缺损 图2 B组AS斑块形成(HE染色，×200) 图3 C组腹主动脉壁B超显示IMT不规则增厚 图4 C组脂斑形成(HE染色，×200) 图5 B组动脉壁PCNA免疫组化染色(×200) 图6 C组动脉壁PCNA免疫组化染色(×200)

3 讨论

血脂异常是AS重要危险因素及启动步骤，高胆固醇血症促进脂质过氧化，形成的氧化型低密度脂蛋白为内皮损伤的关键成分［1］，内皮功能紊乱被认为是AS始动环节，而中膜平滑肌细胞增殖、迁移是AS的重要环节，有多种细胞因子参与。PCNA是一种仅在细胞核内增殖细胞中合成或表达的核内酸性蛋白质，与细胞分裂及增殖状态显著相关，可以作为细胞周期中S期细胞数量的特异性标志，通过检测PCNA的表达，能较好地反映细胞的增殖活性［2］。bFGF是一种多生物学功能的细胞因子，可影响内皮细胞功能，在AS平滑肌细胞增殖、迁移，表型转变及促进多种间充质细胞增殖、分化及细胞外胶原纤维合成中发挥重要作用［3］。本研究16周末A组血脂水平在正常范围，B组、C组TC、TG和LDL-C水平显著增高，光镜下观察到腹主动脉不同程度AS病理形态学改变，反映了由内皮损伤、脂类积聚和细胞增殖等引起的AS发生及进展过程。B组病理可见明显斑块形成，bFGF、PCNA阳性表达显著增多，提示bFGF、PCNA活性增强对内膜增殖的促进作用。辛伐他汀是羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂他汀类药物的一种，在临床上已广泛应用，是目前公认的一类最为常用、有效的基础性降脂药，他汀类降脂药物通过抑制肝细胞合成胆固醇的限速酶而降低TC、TG、LDL-C和升高HDL-C水平，改善血管内皮功能，并可能通过其调脂外的阻断甲羟戊酸的代谢通路而抑制巨噬细胞、白细胞介素、黏附分子等多种炎症因子的表达，抑制脂质在巨噬细胞内的聚集以及平滑肌细胞的增殖迁移等，在抗AS斑块形成方面发挥重要作用［4-5］。本实验C组TC、TG和LDL-C较B组显著降低，病理见斑块形成较B组减少，bFGF、PCNA表达也明显减低，反映了辛伐他汀不仅具有降脂作用，而且能够降低bFGF、PCNA表达，抑制细胞增殖，明显减轻AS进程。

彩色多普勒超声检查能够无创、准确反映斑块的大小、范围，血管壁厚度。其中IMT是超声评价内膜增殖程度的可靠指标，广泛应用于AS早期及进展期定量分析［6］，本研究超声检查显示B组腹主动脉IMT及AS斑块较C组显著增加，与病理形态学结果一致，反映了高胆固醇高脂血症对AS的促进作用及辛伐他汀对斑块消退作用，随着高频超声分辨率的提高及测量方法的标准化，IMT对AS的评价将更加完善。本研究同时应用声学密度定量技术，获取超声波在组织内传播过程中的原始背向散射信号进行定量分析，当超声条件一定，血管壁的声学特性主要由单位组织内胶原、脂质和蛋白质等成分的声学特性决定［7］，脂质的声学密度值低，纤维斑块及钙化斑声学密度值较高，本研究中B组动脉壁内膜增厚，平滑肌、胶原大量增殖，弹力纤维排列紊乱，以纤维性斑块为主要病变特征，斑块声学密度测值较高，而C组内膜仅有薄层脂质沉积，平滑肌及胶原含量少，声学密度测值较B组减低。声学密度定量技术可以反映动脉斑块不同组织成分特征，有助于评价斑块稳定性。由于探头频率、探测深度、伪差等多方面技术因素影响，绝对值常不能客观反映组织学差异，因而采用固定仪器条件并计算内中膜校正回声强度，以尽量消除仪器及个体差异的影响。

高频超声显像及声学密度检测能够定量分析动脉壁形态学及声学密度特征，可作为动态评价AS病变进展及消退的可靠方法。辛伐他汀具有降脂、减低斑块bFGF、PCNA表达及抑制细胞增殖，延缓AS进程的重要作用。近年斑块易损性是AS研究热点，探讨超声评价方法以及他汀类药物稳定斑块的作用有待进一步研究。

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