大肠杆菌油乳剂灭活疫苗的研制及检测

王照军 董丽华 宋倩倩 王明权



大肠杆菌油乳剂灭活疫苗的研制及检测

王照军①董丽华②宋倩倩①王明权③

（①山东农业大学动物科技学院 泰安 271017 ②山东省临清市畜牧中心 ③山东省招远市宋家兽医站）

本试验详细阐述了大肠杆菌油乳剂灭活苗的制备过程，并对灭活苗进行了无菌检查，物理检查，安全检查和效力检查。试验结果表明，该油乳剂灭活苗制作工艺合理，性质稳定，并能对易感动物形成有效保护，保护率达90%，在预防鸡大肠肝菌病的发生中起重要作用。

大肠肝菌 油乳剂 灭活苗 检测

大肠杆菌是引起重要畜禽疾病的病原菌之一，近年来，随着大量高效抗菌药物的普遍应用，大肠杆菌的抗药性也越来越强，这给防治大肠杆菌病带来很大的困难。因此研制大肠杆菌不同血清型的油乳剂疫苗特别是自家灭活疫苗，越来越受到重视并被广泛的采用。本试验对致病性大肠杆菌进行了培养，研制了大肠杆菌油乳剂灭活疫苗，对油乳剂疫苗的制备、检测作以阐述。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 大肠杆菌样品 来自山东聊城临清市5个肉仔鸡养殖场的大肠杆菌病病死鸡，无菌采取心、肝、脾病料，于麦康凯琼脂培养基划线分离纯化培养；并通过试管凝集试验确定其血清型主要为O32，O68，O78，扩大培养作为大肠杆菌种液。

1.1.2 培养基 麦康凯琼脂，普通肉汤，普通琼脂等培养基，购自天津英博伦生化试剂有限公司。

1.1.3 试验动物 家兔和健康鸡，由山东农业大学动科院畜牧场提供。

1.1.4 试剂 10号医用白油；Span-80(去水梨醇单油酸酯)或Span-85(去水梨醇三油酸酯) ，Tween-80(聚氧乙烯脱水山梨酸)；甲醛液、硬脂酸铝。

1.1.5 仪器及设备 光学显微镜，温箱，高压灭菌锅，组织粉碎机，离心机等由山东农业大学动科院临床系实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养液的制备 制备100ml普通肉汤培养基高压灭菌15磅20min冷却；同时制备多个100ml营养琼脂培养基，灭菌备用。

1.2.2 增菌培养及细菌灭活检验 在普通肉汤培养中接种大肠杆菌种液，每个三角烧瓶接种5ml，37℃培养24h后细菌计数。加0.5%的福尔马林灭活菌液24h。

1.2.3 细菌计数(倾注培养法) 检测样品→做成8个适当倍数稀释→选择最后2~3管，每个稀释加1ml于2个平皿中→加营养琼脂培养基(取6个平皿)→37℃，24h培养→计数。

1.2.4 油乳剂的配制及灭活疫苗的制备 白油佐剂配制方法：白油:Span-80:Tween-80=90:7.6:2.4混合再加总重量2%的硬脂酸铝混合均匀，116℃高压灭菌及为白油佐剂。本试验制备的油乳剂为单向性油包水型(W/O)，以10号白油为油相，以Span-80为油相乳化剂，硬脂酸铝为稳定剂，以Tween-80为水相乳化剂。将油相与水相按一定3:1比例混合，组织捣碎机高速10000r/min搅拌5min ，经48h灭活制成油乳剂疫苗，抽检、分装备用。

1.2.5 油苗品质检查 （1）无菌检验。取油乳剂疫苗5ml，接种于普通营养琼脂及厌氧肉汤中，37℃培养24h，观察有无细菌生长。（2）安全检验。取健康的20日龄AA肉鸡5只、家兔2只肌内注射2ml，又取同样数量的肉鸡和家兔腹腔注射2ml，并做对照组，饲养15d，观察肉鸡家兔临床表现。（3）效力检验。取油苗肌肉注射20日龄雏鸡10只，0.13ml/只，另设10只对照，25d以后，用以上致病性大肠杆菌血清型108~109个/只，腹腔注射，观察15d。（4）物理性状检查油苗滴于蒸馏水表面试验：将疫苗滴于蒸馏水表面，观察油苗扩撒程度；粘度测定：用1ml直径1.2mm吸管，室温垂直放出0.4ml，记录所需时间；稳定性测定：油苗经3000r/ min 离心15min；颗粒大小：抹片镜检观察颗粒大小。

2 试验结果

表1 油乳剂灭火苗物理性状检查结果

表2 油乳剂灭火苗安全性及效力检查结果

试验结果表明大肠肝菌种液增菌效果良好，数量多，符合疫苗制作要求；油乳剂灭活为油包水型无细菌，性质稳定，颗粒均匀(表1)。安全性和效力检查结果表明该疫苗安全可靠(表2)。

3 讨论与小结

本试验证明，研制的鸡大肠杆菌油乳剂灭活苗物理性状符合要求，制苗工艺合理，所选菌株可以用于油乳剂灭活苗制苗使用，并能产生较好的免疫应答。

由于大肠杆菌致病性血清型较多，且不同血清型间交叉保护率低。为提高免疫效果，在制备灭活疫苗时宜从本地区或本鸡场分离到的不同血清型的菌株作为制苗菌种，方能取得更好的免疫效果。灭活疫苗的保护率除与血清型有关外，还与疫苗的灭活方法、水相与油相的比例、乳化剂的选择剂量以及乳化工艺有关。

本油乳剂油乳剂经试验证明安全可靠，可以用于本地大肠杆菌病防控。但由于条件有限，本试验在进行在安全性和效力检验时，所用试验动物数量偏少，今后应扩大试验动物数量，保证疫苗安全性。

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（2012–02–23）

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