响应面优化酶催化米糠油甘油解制备甘油二酯

王诗路，刘 辉，咸 漠，*

（1.中国科学院青岛生物能源与过程研究所，山东青岛 266101；2.中国科学院研究生院，北京 100049）

响应面优化酶催化米糠油甘油解制备甘油二酯

王诗路1，2，刘 辉1，咸 漠1，*

（1.中国科学院青岛生物能源与过程研究所，山东青岛 266101；2.中国科学院研究生院，北京 100049）

利用响应面（RSM）对叔丁醇溶剂体系中的脂肪酶Novozym 435催化米糠油甘油解反应合成甘油二酯（DAG）的反应条件进行了优化。在单因素实验基础上选取反应温度、反应时间、酶添加量（酶和米糠油质量比）、底物质量比（米糠油∶甘油）等4个因素作为自变量，以DAG的产率为响应值，进行5水平4因素中心组合旋转设计（CCRD）优化，确定了影响DAG合成的关键因素以及最佳反应条件。分析结果表明，在各影响因素中，底物质量比对DAG的产率影响最大。综合考虑优化和节约后，利用模型计算DAG合成的最佳条件：反应温度60℃，反应时间10.5h，加酶量10.66%，底物质量比16，在此条件下DAG产率是53.08%。

响应面，甘油二酯，米糠油，甘油解

甘油二酯（diacylglycerol，DAG）是天然油脂的组分之一。DAG包括两种同分异构体，分别是sn-1，3-DAG和sn-1，2（2，3）-DAG，它们在天然产物中的比例约为7∶3[1]。DAG的能量值和可消化性与甘油三酯相近[2]。近年来大量实验表明，与传统的甘油三酯相比较，DAG具有降体脂、降血脂、抑制体重增加等功能[3-5]，因此是一种更利于身体健康的食用油料。1999年，日本花王公司将DAG含量为80%的新型食用油投入市场；2005年，该产品又成功进入全美市场进行销售[6]。目前，国内DAG尚处于研发阶段，市场上还没有相关产品[7]。米糠油是一种营养丰富的植物油，食后吸收率达90%以上[8]。米糠油与其他食用油相比，具有降胆固醇、降血压、加速血液循环、刺激体内激素分泌、促进人体发育等作用，是有益于人体健康的保健油，有的还将其美誉为“青春油”[9]。此外，我国的稻谷年产量在1.9亿t左右，年产米糠约1000万t；如果一半用于制油，可年产食用精炼米糠油60万t左右，生产潜力巨大[10]。因此，利用米糠油作为原料制备DAG，不但可以满足对于原料营养成分的要求，而且由于原料来源丰富，可以实现产业化。本研究是选用固定化脂肪酶Novozym 435，在叔丁醇溶剂体系中催化米糠油和甘油通过甘油解反应合成DAG。在单因素实验的基础上，采用响应面考察反应温度、反应时间、加酶量、底物质量比（米糠油∶甘油）4个因素对DAG产率的影响，探索DAG合成的最佳条件，对脂肪酶催化的米糠油甘油解制备DAG的条件进行优化，为提高合成DAG产量和效率提供理论基础和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米糠油 辽宁中稻股份有限公司；Novozym 435（酶活10000PLU/g，注：在标准反应条件下每分钟生成1μmol的丙基月桂酸脂所需的酶量为一个单位，用PLU表示） 诺维信（中国）生物技术有限公司；三油酸甘油酯、1，2-二棕榈酸甘油酯、1，3-二油酸甘油酯、单油酸甘油酯 Sigma-A ldrich中国公司，色谱标准品；甘油、叔丁醇、正己烷、异丙醇、乙醚和甲酸 国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

BT-224S电子分析天平 德国Sartorius公司；Sigma 1-14型离心机 德国SIGMA公司；HZS-HA恒温水浴振荡器 北京东联哈尔仪器制造有限公司；IATROSCAN MK-6S棒状薄层色谱-火焰离子检测分析仪（TLC/FID） 日本三菱雅特隆公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甘油解反应 精确称取6g米糠油和一定质量比的甘油置于带塞的100m L锥形瓶中，然后加入一定量的固定化脂肪酶（Novozym 435），再加入6g叔丁醇，并放入一定的温度、转速为150r/m in的恒温水浴振荡器中反应，一定时间后取出20μL样品，用1m L正己烷∶异丙醇（v∶v，10∶1）溶解后，离心除去固定化酶，滤液低温静置保存待分析。

1.2.2 TLC/FID测定DAG含量 将色谱棒放人扫描架中，扫描仪的扫描模式设置为空白扫描模式。之后，将色谱棒架置于点样板上，用微量分配器取样1μL，点在各色谱棒的零点位置。色谱棒架放入展层缸，展层液组分为正己烷∶乙醚∶甲酸=42∶28∶0.3（v∶v∶v）。当溶剂前沿到达100mm处时，取出色谱棒放入干燥器（120℃下干燥2~3m in）。展开剂完全被清除后，放入扫描架中进行扫描（氢气流量160m L/m in，空气流量2L/min，扫描速率：0.5min/s）。依据三油酸甘油酯（TAG）、1，2-二棕榈酸甘油酯（1，2-DAG）、1，3-二油酸甘油酯（1，3-DAG）和单油酸甘油酯（MAG）标准品的保留位置来确定样品中的甘油酯类别。分别以各自的峰面积为纵坐标Y，浓度为横坐标X绘制标准曲线，得出回归方程：YTAG=8368.6XTAG，R2=0.9937；Y1，2-DAG=7777.3X1，2-DAG，R2=0.9943；Y1，3-DAG=8983.5X1，3-DAG，R2=0.9839；YMAG=6402.3XMAG，R2=0.9985。

DAG产率计算公式如下：

1.2.3 单因素实验 在预实验的基础上，选择反应温度（℃）、反应时间（h）、加酶量（酶与米糠油质量比，%）、底物质量比（米糠油与甘油质量比）这4个因素进行单因素实验，分别考察其对DAG产率的影响，确定各因素的优化区间。反应步骤见甘油解反应，选择反应温度为40、50、60、70℃；反应时间为4、6、8、12h；加酶量为2%、4%、8%、12%、16%；底物质量比为5、10、15、20、25。每组实验做3个平行样，取其平均值。

1.2.4 响应面实验设计和分析 在单因素实验结果的基础上，本实验依据RSM中的CCRD原理，采用Design-Expert 8软件设计并分析4因素5水平共30组独立随机实验。实验选取反应温度（℃）、反应时间（h）、加酶量（酶与米糠油质量比，%）、底物质量比（米糠油与甘油质量比）这4个因素，以产物中DAG的质量分数（%）为响应值Y。每组实验做3个平行样，取其平均值。实验因素水平编码设计见表1。

表1 实验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 模型的验证 通过响应面分析法优化Novozym 435催化米糠油甘油解制备DAG反应。在优化的反应条件下检测DAG产率，通过比较预测值和实验值来验证模型的有效性。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 反应温度对DAG产率的影响 反应温度对DAG产率的影响结果见图1。

图1 反应温度对DAG产率的影响Fig.1 Influence of reaction temperature on DAG yield

由图1可知，反应温度从40℃升至50℃，DAG产率上升；从50℃升至60℃，DAG产率呈下降趋势。之后，从60℃升至70℃，DAG产率再次上升。在其它条件不变的情况下，单因素实验结果显示，反应温度在40℃时DAG产率低于50%，在50~70℃区间均高于50%，说明反应适宜温度范围为50~70℃。

2.1.2 反应时间对DAG产率的影响 反应时间对DAG产率的影响结果见图2。

图2 反应时间对DAG产率的影响Fig.2 Influence of reaction time on DAG yield

由图2可知，反应时间从4h到6h，DAG产率略有下降；从6h到12h，DAG产率逐渐上升。在其它条件不变的情况下，单因素实验结果显示，反应时间在4h至12h之间，DAG产率波动范围为0.45%，说明在此时间段内反应时间对于DAG产率的影响较小。

2.1.3 加酶量对DAG产率的影响 加酶量对DAG产率的影响结果见图3。

图3 加酶量对DAG产率的影响Fig.3 Influence of enzyme amounton DAG yield

由图3可知，加酶量从2%增加到8%，DAG产率升高；从8%增加到16%，DAG产率下降。在其它条件不变的情况下，单因素实验结果显示，反应适宜加酶量在4%~12%之间。

2.1.4 底物质量比对DAG产率的影响 底物质量比对DAG产率的影响结果见图4。

图4 底物质量比对DAG产率的影响Fig.4 Influence of substratemass ratio on DAG yield

由图4可知，底物质量比从5增加到15，DAG产率显著上升；从15增加到25，DAG产率显著下降。在其它条件不变的情况下，单因素实验结果显示，底物质量比在5至25之间，DAG产率波动范围为17.5%，说明底物质量比对于DAG产率的影响显著。

2.2 响应面实验结果分析

2.2.1 方差分析 根据表1中的实验因素与水平的设计进行了30组实验，实验结果见表2。对表2的实验数据进行方差分析，回归模型方差分析结果见表3。

采用Design Expert软件，对表2中实验数据进行回归拟合，得到二次多项回归方程：

表2 响应面实验设计方案及结果Table 2 Results of response surface experiments

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance

回归模型方差分析见表3。结果表明：模型p＜0.0001，模型达到极显著水平，且失拟项p=0.1108＞0.05，失拟不显著。此外，模型的复相关系数R2=0.9075，校正系数R2Adj=0.8212，表明模型能解释82.12%响应值的变化。以上分析表明该模型变量与自变量之间的模型关系显著，拟合程度比较好，实验误差小，可以用此模型对DAG产率进行分析和预测。

根据回归系数估计值可知，各因素贡献率为：D＞C＞B＞A，即底物质量比＞加酶量＞反应时间＞反应温度。模型中的一次项C、D和二次项D2极显著，二次项AC显著。说明底物质量比和加酶量这两个因素对于DAG产率主效应明显，反应温度和加酶量对DAG产率有交互作用的影响。

2.2.2 响应面分析 通过对模型响应面以及相对应的等高线进行分析，并对模型进行优化，从而得到脂肪酶Novozym 435催化米糠油甘油解生成DAG的最佳反应条件。模型的响应面及其等高线见图5。

图5 响应面及其等高线图Fig.5 Response surface plotand contour plot

由图5可知，除加酶量和反应温度存在显著的交互作用外，其他的两因素之间均无显著交互作用。加酶量和反应温度之间的关系是：在其他条件固定，当要得到相同的DAG产率时，升高反应温度，则所需的酶量减少；增加加酶量，则所需的反应温度降低。此外，在底物质量比和其他3个因素的交互作用中，底物质量比均是影响DAG产率的主要因素，由此可以推导出底物质量比是4个因素中是影响DAG产率的最主要因素。

2.3 模型优化与验证

Novozym 435是可以多次重复使用的固定化酶，虽然可以在70℃及以上温度维持酶活，但是适宜的反应温度范围是40~60℃，高温会加速酶的热失活，降低使用寿命，增加平均成本并且浪费能源[11]。为兼顾优化和节约，将反应温度设定为50~60℃，再利用Design Expert软件分析，得出最佳反应条件为：反应温度60℃，反应时间10.5h，加酶量10.66%，底物质量比16，此时DAG产率预测值为52.84%。在此条件下进行三次实验，平均值为53.08%，高于模型预测值0.45%，与预测值无显著差异。说明采用响应面优化得到的DAG产率数据准确可靠，具有实用价值。此外，张超等[12]利用Novozym 435催化紫苏籽油生成DAG的研究的最佳条件是：反应温度75℃，反应时间14.5h，加酶量11.8%，底物摩尔比（甘油∶紫苏籽油）=1∶1.5，此条件下得到的DAG含量的理论值为52.67%，实际值为54.33%。由此可见，尽管最优条件并不相同，但是Novozym 435催化这两种油脂发生甘油解反应具有相近的反应极值。

3 结论

利用Design Expert软件，在单因素实验的基础上采用响应面分析法优化Novozym 435催化米糠油甘油解的实验条件，并且兼顾优化和节约的原则，得到DAG的最佳生产条件为：反应温度60℃，反应时间10.5h，加酶量10.66%，底物质量比16。在此条件下，DAG产率平均值是53.08%，与预测值无显著差异。

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Optim ization of diacylglycerolproduction from lipase-catalyzed glycerolysis of rice bran oilby response surface methodology

WANG Shi-lu1，2，LIU Hui1，XIAN M o1，*
（1.Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266101，China；2.Graduate University of Chinese Academy of Science，Beijing 100049，China）

Response surface methodology（RSM）was app lied to op tim ize the d iacylg lycerol（DAG）p roduction from Novozym 435-catalyzed g lycerolysis of rice b ran oil in t-Butanolsystem.Based on sing le-factor analysis，5-level-4-factor central com posite rotatab le design（CCRD）was emp loyed to evaluate and op tim ize the effect of DAG synthesis parameters，such as reaction tem perature，time，enzyme amount（mass ratio of lipase to rice b ran oil），and substrate mass ratio（rice b ran oil∶g lycerol）.The results ind icated that substrate mass ratio was the most im portant variab le.Considering the econom ical efficiency as well as op tim ization，the op timum DAG synthesis conditions w ith the yield of 53.08%were as follows：reaction tem perature 60℃，time 10.5h，enzyme amount10.66%，substrate mass ratio 16.

RSM；DAG；rice b ran oil；g lycerolysis

TS221

A

1002-0306（2012）14-0192-04

2011－10－13 *通讯联系人

王诗路（1984-），女，博士研究生，研究方向：生物合成与生物转化。

国家自然科学基金青年科学基金项目（21106170）。