基于COI部分序列探讨南海鲳属鱼类系统进化与种群遗传结构

孙 鹏, 尹 飞, 施兆鸿, 彭士明

(中国水产科学研究院 东海水产研究所, 农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室, 上海 200090)

基于COI部分序列探讨南海鲳属鱼类系统进化与种群遗传结构

孙 鹏, 尹 飞, 施兆鸿, 彭士明

(中国水产科学研究院 东海水产研究所, 农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室, 上海 200090)

利用线粒体细胞色素 c氧化酶Ⅰ亚基(COI)部分序列研究了南海区鲳属鱼类(Pampus)银鲳(P. argenteus)、珍鲳(P. minor)和中国鲳(P. chinensis)的系统进化与种群遗传结构。通过PCR扩增与序列测定获得了长度为643 bp的COI基因片段, 其A、T、G、C碱基的平均含量分别为25.4%、33.6%、18.9%和22.1%, A+T含量高于G+C含量。64条序列共定义了20种单倍型, 包含152个变异位点, 简约信息位点148个, 单变异位点4个, 产生169个点突变。结果表明, 银鲳与中国鲳的遗传差异最小, 银鲳与珍鲳的其次, 而珍鲳与中国鲳的遗传差异最大, 3种鲳属鱼类的遗传多样性均呈现较低的水平, 应采取有效的保护措施, 以避免其遗传多样性水平的进一步丧失。本研究结果为鲳属鱼类资源保护和合理开发利用提供必要的参考。

鲳属鱼类(Pampus); 细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COI); 序列变异; 系统进化

鲳属(Pampus)鱼类属于硬骨鱼纲(Osteichthyes),鲈形目(Perciformes), 鲳科(Stromateidae), 为近海暖水性中下层鱼类。它广泛地分布于中国沿海、印度洋、太平洋沿岸, 由于其具有很高的营养价值和经济价值, 深受消费者青睐, 是中国沿海重要的经济鱼类[1]。过去, 中国分类学家曾将中国海区的鲳属鱼类分成3类[2-3], 即银鲳(P. argenteus)、灰鲳(P. cinereus)和中国鲳(P. chinensis)。而刘静等[4-5]则建议将中国的鲳属鱼类分为5类, 即： 银鲳、灰鲳、中国鲳、珍鲳(P. minor)和翎鲳(P. punctatissimus)。在5种鲳鱼中,灰鲳和翎鲳在中国东海区较多, 而在南海区较为少见; 银鲳广泛地分布于中国各沿海地区; 中国鲳分布于台湾海峡中南部至南海北部沿海, 在中国福建龙江、厦门以南至广东、广西和海南沿海很常见; 珍鲳仅分布于南海北部和台湾海峡南部大陆沿岸, 最北分布到福建厦门一带, 是广东、广西以及海南岛沿海常见的种类[5]。因此, 银鲳、中国鲳和珍鲳属于中国南海区主要的鲳属鱼类渔获对象。

南海是世界上海洋动物区系最具多样性的海区之一, 中国在南海的渔业活动主要在南海北部大陆架和北部湾。研究表明, 南海北部海域渔业资源均处于过度开发状态, 受捕捞压力和生态环境变化的影响, 渔业资源的优势种群出现明显的变化[6-7]。迄今为止, 有关南海区鲳属鱼类资源的种群结构和遗传背景等方面的研究较少。目前, 仅在银鲳中见到种群遗传多样性方面的报道[8-9], 而有关中国鲳和珍鲳遗传背景与种群动态的研究至今尚未见到。细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit Ⅰ, COI)序列进化速度较快, 其不仅适合于种群水平遗传多样性的检测, 也可用于种间分析。目前, 已被广泛地应用于物种的分子系统学和种群遗传学研究中。例如, 冯建彬等[10]利用 COI序列对中国五大淡水湖日本沼虾群体进行了分析, 发现群体间具有较高的遗传分化; 毕潇潇等[11]利用 COI等基因序列分析了 4种鳕鱼的系统进化; 彭士明等[12]利用线粒体控制区与COI基因序列比较了养殖银鲳与野生银鲳群体的遗传变异情况。本研究通过对南海区鲳属鱼类——银鲳、珍鲳和中国鲳群体的mtDNA COI序列片段进行扩增与测序分析,比较了 3种鲳属鱼类的遗传变异、系统进化、种群遗传结构与遗传多样性水平, 以期为中国南海区鲳属鱼类资源的研究、保护及合理开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用鲳鱼样品共64尾, 其中包括银鲳个体20尾, 珍鲳个体23尾, 中国鲳个体21尾, 所有样品均采自于海南琼海附近海域, 平均叉长分别为 21.8 cm±5.2 cm、17.1 cm±3.7 cm和 23.6 cm±6.9 cm。取其背部肌肉组织保存于－20℃保存备用。

1.2 基因组DNA提取、COI基因片段扩增与测序

取样品肌肉100 mg左右, 采用常规的酚-氯仿法提取基因组DNA[13], 并于-20℃下保存备用。扩增所用引物采用COI a： AGT ATA AGC GTC TGG GTA GTC 和 COI f： CCT GCA GGA GGA GGA GAY CC[14]。PCR 总反应体积为 50 μL, 反应体系为：10×PCR buffer 5.0 μL, Mg2+终浓度为 2.0 mmol/L, 两条引物(10 μmol/L)各 2 μL, dNTPs (各 2.5 mmol/L)4μL, Taq 酶(TaKaRa, 5 U/μL)0. 4 μL, 模板 2.0 μL, 最后以ddH2O补足体积。反应程序为： 94 ℃预变性5 min; 94℃变性30 s; 52℃退火30 s; 72℃延伸45 s, 共30个循环; 最后72 ℃延伸10 min。

PCR扩增产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后,用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海华舜)纯化,送至上海桑尼生物技术有限公司进行序列测定, 测序仪为ABI 3730基因分析仪。

1.3 数据分析

测序结果采用Clustal X 1.81[15]进行比对, 并辅以人工校对。用DNASP 4.0[16]计算(haplotype diversity, h)、核苷酸多样性(nucleotide diversity, Pi)、简约信息位点(parsimony informative sites)数。用MEGA 4.0[17]分析不同序列的碱基组成、变异位点、核苷酸差异等, 计算个体间的遗传距离, 并采用邻接法(Neighbor-joining method, NJ)基于Kimura双参数模型(Kimura 2-parameter, K2P)构建单倍型系统树, 以中间低鳍鲳(Peprilus medius)(Genbank号： AB205449)作为外群, 进化树中节点的自举置信度水平由自引导值(Bootstrap value)估计, 重复次数为1 000。

2 结果

2.1 3种鲳属鱼类 COI基因片段的序列特征

对 3种鲳属鱼类 COI基因片段进行测序, 经过人工校正和序列比对, 获得64条长度为643 bp的3种鲳属鱼类 COI基因同源序列(Genbank号：JF790260～JF790279)。64条 COI序列共定义了 20个单倍型, 检测到152个核苷酸变异位点(图1)(占总位点数的23.6%), 产生169个点突变。其中, 包含简约信息位点 148个, 单一位点 4个, 没有碱基的插入/缺失。序列中共发生53个转换(transition)和15个颠换(transversion), 转换与颠换的比值为3.64。

3种鲳属鱼类的A、T、G和C百分含量依次为25.4%、33.6%、18.9%和22.1%, A+T的含量(59.0%)明显高于G+C的含量(41.0%), 而3种鲳属鱼类的碱基组成相似, 物种之间无明显差异(表 1)。碱基使用频率比较发现, 密码子中 4种碱基出现频率具有较大的差别, 其中变化最大的是G, 序列第1、2、3位点的 G平均含量在银鲳中分别为 32.1%、16.4%和8.9%, 在珍鲳中分别为31.2%、16.8%和7.4%, 在中国鲳中分别为33.0%, 16.8%和7.1%。

2.2 南海区3种鲳属鱼类种群遗传结构

3种鲳属鱼类各单倍型之间的遗传距离见表2。在 3种鲳属鱼类中, 珍鲳与中国鲳单倍型之间的遗传距离为 0.1904～0.2015, 平均为 0.1975±0.0189, 遗传差异最大; 珍鲳与银鲳的遗传距离为0.1806～0.1892, 平均为 0.1856±0.0185, 遗传差异程度次之; 银鲳与中国鲳遗传距离为 0.1719～0.1871,平均为 0.1787±0.0176, 遗传差异最小。采用邻接法基于双参数模型构建的系统树如图 2所示, 中间低鳍鲳(Peprilus medius)作为外群。3种鲳属鱼类的20个单倍型被分为 3支, 其中银鲳与中国鲳两种首先聚为一支, 然后再与珍鲳聚在一起。结果表明, 银鲳与中国鲳的亲缘关系较近, 而与珍鲳的遗传关系较远。在图2中, Bootstrap 置信度较高, 特别是在3种鲳属鱼类的分支上, 均达到100%。

2.3 南海区3种鲳属鱼类种群遗传多样性

3种鲳属鱼类的单倍型多样性(h)与核苷酸多样性(Pi)水平见表3所示。20种单倍型中包括银鲳单倍型3个、珍鲳单倍型7个和中国鲳单倍型10个。其中中国鲳的单倍型多样性和核苷酸多样性水平均为最高(0.890和0.00491), 而银鲳的遗传多样性水平最低(0.195和0.00062), 但3种鲳属鱼类的遗传多样性水平均处于较低的水平。Fu and Li's D和Tajima's D中性检验由DNASP 4.0软件进行, 在银鲳群体中Fu and Li's D 值为-2.62685(P＜0.05), 珍鲳中为 D=-1.31246(P＞0.05), 中国鲳中为 D=-0.19574(P＞0.05);银鲳种群的 Tajima's D 中性检验结果为D=-1.86788(P＜0.05), 珍鲳中为 D=-1.35615(P＞0.05),中国鲳中为 D=0.86993(P＞0.05), 表明南海区银鲳群体经历了种群扩张现象。

图1 3种鲳属鱼类COI序列的变异位点分布Fig. 1 Variable sites of mitochondrial COI sequences in three Pampus speciesPA. 银鲳; PC. 中国鲳; PM. 珍鲳PA. Pampus argenteus; PC. Pampus chinensis; PM. Pampus minor

表1 3种鲳属鱼类COI基因序列碱基组成Tab. 1 Nucleotide frequencies of COI sequences in three Pampus species

3 讨论

3.1 鲳属鱼类的系统进化关系

本研究通过线粒体COI基因片段研究了中国南海区银鲳、珍鲳和中国鲳等 3种鲳属鱼类的系统分化与种群遗传结构。其中, 中国鲳与银鲳的遗传差异较小, 而珍鲳属于较早分化出来的物种, 与中国鲳和银鲳的亲缘关系较远, 3种鲳属鱼类均达到了种的分化程度。而银鲳、珍鲳和中国鲳的种内遗传距离分别为 0.0042、0.0034和 0.0056, 远小于 0.10的种内差异范围[18], 表明南海区的 3种鲳属鱼类均未构成亚种的分化。

表2 3种鲳属鱼类各单倍型之间的遗传距离Tab. 2 Genetic distances among haplotypes of three Pumpus species based on Kimura 2-parameter method

图2 基于3种鲳属鱼类COI基因序列单倍型构建的NJ系统发生树Fig. 2 NJ phylogenetic tree based on COI haplotypes of three Pumpus species

表3 3种鲳属鱼类单倍型多样性和核苷酸多样性Tab. 3 Nucleotide diversity and nucleotide diversity of three Pampus species

长期以来, 鲳属鱼类的分类一直是分类学家争论的焦点。日本学者 Yamada[19]和 Nakabo[20]曾将鲳属鱼类分为 3种, 即银鲳、中国鲳和镰鲳(P. echinogaster)。而刘静等[5,21]根据鲳属鱼类的形态特征的变化规律与差异建议将中国的鲳属鱼类分为 5类,即银鲳、灰鲳、中国鲳、珍鲳和翎鲳。对 5种鲳属鱼类的18项特征进行分析所得出的5种鲳属鱼类的系统发育关系图表明, 5种鲳属鱼类的亲缘关系依次为灰鲳、翎鲳、中国鲳、银鲳和珍鲳, 也就是说灰鲳、翎鲳和中国鲳的亲缘关系较近, 其次是与银鲳的关系, 而珍鲳与其余4种鲳属鱼类的亲缘关系较远。本研究所取样品按照刘静等[21]的特征分析并加之分子鉴定, 分别属于其中的银鲳、中国鲳和珍鲳3类, 而与其他两种鲳属鱼类(翎鲳和灰鲳)的特征差异较大。序列分析结果也与刘静等[5]的研究结果相一致, 即中国鲳与银鲳的亲缘关系较近, 与珍鲳的亲缘关系较远, 所构建的系统进化树中各分支的可信度均达到100%。而Cui等[3]通过对5种鲳属鱼类的COI序列分析, 认为银鲳与珍鲳的亲缘关系稍近, 之后才与其他 3种鲳属鱼类即翎鲳、中国鲳和灰鲳所组成的 1支聚在一起。通过与银鲳的COI基因全序列(Genbank号： EU357803.1)比对发现, 本研究所获得的序列为COI基因序列664 bp～1 300 bp附近区域,而 Cui等[3]所扩增的为COI基因序列 73 bp～702 bp附近区域。基因不同区域结构与保守性的差异也许是系统进化关系分析结果不同的原因。由此可见, 利用单一分子标记评估鲳属鱼类的种群遗传多样性差异还不够, 应进一步运用多种分子标记结合起来进行研究, 以得出更全面、客观的结论。

3.2 南海区 3种鲳属鱼类的种群结构与遗传多样性

遗传多样性不仅是形成生物多样性的基础, 也是物种进化潜能的保证。遗传多样性的降低或者丧失, 将会降低物种对外界环境的适应能力[22]。核苷酸多样性(Pi)是表示每个群体内各个单倍型的两两配对差异的平均值, 是一个重要的群体遗传多样性指标。3种鲳属鱼类中, 中国鲳的单倍型多样性和核苷酸多样性水平均为最高(h=0.890,Pi=0.00491), 珍鲳中的次之(h=0.696,Pi=0.00168), 银鲳的遗传多样性水平最低(h=0.195,Pi=0.00062), 但总的来说, 3种鲳属鱼类的遗传多样性水平均处于较低的水平。Grant等[23]根据单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(Pi)两者的关系将种群事件分为 4种模式： 第一类为h和Pi均低(h＜0.5,Pi＜0.005); 第二类为h高而Pi低; 第三类为h低而Pi高; 第四类为h和Pi均高。本研究中银鲳即属于第一类情况, 其单倍型和核苷酸变异的多样性水平均较低, 表明其最近发生了种群瓶颈效应或由单一、少数系群所发生的创立者效应(founder effect)。珍鲳和中国鲳群体属于第二类, 其形成的原因可能为瓶颈效应后伴随着迅速的种群成长与突变的积累。

鲳属鱼类为中国重要的海产鱼类, 但是由于近年来的过度捕捞和环境污染, 中国多个海区的鲳鱼渔业资源都呈现衰减的趋势, 不但鱼类种群的数量急剧下降, 而且渔业资源结构也发生了改变。研究发现, 渤海、黄海和东海区环境的恶化及捕捞强度的增大导致银鲳资源严重衰退, 且资源结构呈现低龄化、小型化[24-27]。但截至目前, 有关南海区鲳属鱼类资源的种群结构和遗传背景等方面的研究较少, 仅在银鲳中见到过遗传多样性相关的报道。例如, 孟彦羽等[8]通过 RAPD分析发现南海海区的银鲳种群遗传多样性水平较其他几个海区低; 彭士明等[9,28]通过对银鲳COI基因和线粒体控制区序列的分析, 也发现南海区银鲳资源的遗传多样性处于较低的水平,而有关中国鲳和珍鲳种群遗传方面的研究至今尚未见过报道。此外, 研究表明近 30 a间南海北部大陆架和北部湾底拖网渔获密度的下降程度非常显著,分别下降 72%和 81%, 南海北部海域底拖网渔业资源均处于过度开发状态, 特别是沿岸和近海过度开发情况最为严重, 受捕捞压力和生态环境变化的影响, 南海渔业资源的优势种群出现明显的变化[6-7]。可以推测, 南海区鲳属鱼类的状况亦不容乐观。如果持续下去, 必将产生严重的后果, 如成活率、生长与繁殖效率下降, 降低种群个体对变化的环境的适应能力, 并最终导致物种的灭绝[29]。为了恢复和可持续利用渔业资源, 自 1999年起, 农业部开始在南海海域实施伏季休渔制度, 并调整海洋捕捞结构和经济增长方式, 大力开展人工鱼礁和增殖放流, 对改善南海海域生态环境和恢复渔业资源起到了重要的作用。此后的几年间, 渔业资源可持续利用水平开始波动上升[30]。今后, 还必须加强对水生生物的养护, 保护其产卵场渔业资源和渔业水域环境, 以实现鲳属鱼类及其他南海渔业资源的健康可持续性利用。

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Phylogenetic relationships and population structure of Pampus in the South China Sea inferred from COI gene segments

SUN Peng, YIN Fei, SHI Zhao-hong, PENG Shi-ming
(Key and Open Laboratory of Marine and Estuarine Fisheries Resources and Ecology, Ministry of Agriculture, East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China)

Mar., 3, 2011

Pampus; mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ (COI); sequence variation; phylogenetic evolution

Sequence variation and population genetic structure of Pampus argenteus, P. minor and P. chinensis in the South China Sea were evaluated using a 643 base pair fragment of mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ (COI) gene. The average contents of A, T, G and C were 25.4%, 33.6%, 18.9%, and 22.1%, respectively. The content of A+T was much higher. In 64 COI sequences, a total of 152 polymorphic sites (including 148 parsimony informative sites and 4 singleton variable sites) formed 169 mutations, and defined 20 distinct haplotypes. P. minor and P. chinensis had the largest genetic divergence, whereas P. argenteus and P. chinensis had the least genetic divergence. All three pampus populations presented low level of genetic diversity. Therefore, certain efficient measures should be made to avoid further decline of genetic diversity in those species. The present results provide basic information for the conservation and sustainable exploitation of Pampus species.

Q347

A

1000-3096(2012)06-0015-07

2011-03-03;

2011-04-11

国家科技支撑项目(2011BAD13B01); 上海市农委重点项目(沪农科攻字20074-1); 中央级公益性科研院所基本科研业务费项目(东2009M05, 东2009M08)

孙鹏(1980-), 男, 山东枣庄人, 助理研究员, 博士; 主要从事海水鱼类繁殖发育与种群遗传学研究, E-mail： sunpeng1128@163.com; 施兆鸿, 通信作者, E-mail： shizhh@hotmail.com

(本文编辑：谭雪静)