脑出血后高血糖血肿周围脑组织ATP与NO的关系研究

王小蓉 吴 勇 陈 娅 张琼桂 李小刚

脑出血是临床常见病和多发病之一。近年来从许多方面对其机制作了很多研究［1～3］。通过临床观察发现脑出血急性期合并血糖增高，加重脑损伤，影响预后。而高血糖导致脑损伤的原因尚不清楚。本实验采用自体血注入法制作大鼠脑出血模型，通过监测大鼠血糖、血肿周围脑组织ATP和NO含量，分析ICH后高血糖加重脑损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠100只（购自泸州医学院实验动物中心），重250～320 g，5～7月龄。

1.1.2 主要试剂 ATP试剂盒（由南京建成生物医学工程研究所提供）；NO试剂盒（由南京建成生物医学工程研究所提供）。

1.1.3 主要仪器 WDT-V型大鼠脑立体定位仪（西安光电仪器厂产品）；722光栅分光光度仪（上海第三分析仪器厂产品）；美国强生电子血糖仪。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 实验动物随机分为假手术组（SO，n＝25）；单纯ICH 组（PCH，n＝25）；ICH后高血糖组，该组又分为2 g／kg（2G组）和4 g／kg（4G组）注射葡萄糖组（n均＝25）；参照 Xue、Yang的方法制备大鼠ICH模型［4，5］；SO组仅进行手术过程；PCH组注入自体不凝血50μl；高血糖组在注入自体血50μl后按2 g／kg和4 g／kg予以50%的高渗葡萄糖腹腔注射；分别在术后1、3、7、10、14 d终止观察，取血肿周围脑组织块分别作脑组织ATP和NO含量测定。

1.2.2 血糖监测 临手术的大鼠前一晚禁食，分别于术前、术后1、6 h取鼠尾血测血糖。

1.2.3 ATP含量测定 将取得的脑组织块（1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm）冻融后于0.4 mol／L HCIO4中制成10%的匀浆；低温离心（－4℃，5 000 r／min，20 min），取上清液0.2 ml加3 mol／L K2CO30.1 ml中和 HClO4，漩涡振荡2 min，高速离心（15 000 r／min，3 min），取50 ul上清液装入 EP管备用，采用高效液相色谱法测定ATP含量。由泸州医学院附属医院检验科协作完成并计算。

1.2.4 NO含量测定 将取得的脑组织块（1.0 mm×1.0mm×1.0mm）采用硝酸还原酶法测定。由泸州医学院附属医院检验科协作完成并计算。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 术后各组血糖水平变化（表1）

表1 各组不同时间点血糖水平变化（±s，mmol／L）

表1 各组不同时间点血糖水平变化（±s，mmol／L）

注：与SO组比较，＊P＜0.05；与PCH组比较，▲P＜0.05；与2G组比较，＃P＜0.05

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与SO组比较，脑出血3组血糖水平在术后1、6 h升高（P＜0.05）；与PCH组比较，2G和4G组明显升高（P＜0.05），4G组明显高于2G组（P＜0.05）。

2.2 术后各组血肿周围脑组织NO含量变化（表2）

与SO组比较，脑出血3组血肿周围脑组织NO含量，大鼠术后1 d开始升高，3 d升至最高（P＜0.05），7～10 d仍然具有统计学意义；与PCH组比较，2G和4G组明显升高（P＜0.05），4G组明显高于2G组（P＜0.05）。

2.3 术后各组血肿周围脑组织ATP含量（表3）

与SO组比较，脑出血3组血肿周围脑组织ATP含量，大鼠术后1 d开始降低，3 d降至最低（P＜0.05），7～10 d仍然具有统计学意义；与PCH组比较，2G和4G组降低（P＜0.05），4G含量组明显低于2G组（P＜0.05）。

表2 术后血肿周围组织NO含量（±s，umol／L）

表2 术后血肿周围组织NO含量（±s，umol／L）

注：与SO组比较，＊P＜0.05；与PCH组比较，▲P＜0.05；与2G组比较，＃P＜0.05

组别 只数NO含量1 d 3 d 7 d 10 d 14d 29 PCH组 25 2.56±1.73＊ 2.86±1.68＊ 2.73±1.45＊ 2..52±1.56＊ 2.36±1.49＊2G组 25 2.76±1.33＊▲ 3.32±1.69＊▲ 2.98±1..78＊▲ 2.86.±1.46＊▲ 2.40±1.42＊▲4G组 25 2..92±1.46＊▲＃ 3.86±1.51＊▲＃ 3.32±1.65＊▲＃ 3.12±1.67＊▲＃ 2.52±1.47＊▲＃SO组 25 2.14±1.18. 2.10±1.30 2.22±1.20. 2.16±1.42 2.18±1.

表3 术后不同时间点血肿周围组织ATP含量的变化（±s，μg／g）

表3 术后不同时间点血肿周围组织ATP含量的变化（±s，μg／g）

注：与SO组比较，＊P＜0.05；与PCH组比较，▲P＜0.05；与2G组比较，＃P＜0.05

组别 只数ATP含量1 d 3 d 7 d 10 d 14d 32 PCH组 25 10.30±0.18＊ 7.08±0.09＊ 8.04±0.11＊ 9.03±0.04＊ 10.78±0.14＊2G组 25 9.77±0.10＊▲ 5.94±0.15＊▲ 6.26±0.15＊▲ 8.55±0.18＊▲ 10.22±0.13＊▲4G组 25 7.73±0.15＊▲＃ 3.44±0.14＊▲＃ 4.49±0.17＊▲＃ 7.93±0.13＊▲＃ 9.87±0.12＊▲＃SO组 25 11.45±0.28 11.30±0.17 11.48±0.24 11.16±0.22 11.20±0.

2.4 术后各组血肿周围脑组织ATP含量与脑组织NO量相关性分析

ATP与脑组织NO含量：2G组（r＝－0.836，P＜0.05），4G组（r＝－0.889，P＜0.05），均呈负相关。

3 讨 论

近年来脑卒中后血糖浓度的改变对脑组织的损伤以及对预后的影响也引起了人们的重视。研究资料显示：ICH后高血糖可使病情加重，病死率和致残率增高，预后差。脑出血后高血糖导致脑损伤的可能机制已经做了一些研究［6，7］。

本实验发现，与SO组比较，脑出血3组血肿周围脑组织ATP含量降低（P＜0.05）；与PCH组比较，2G组和4G组大鼠血肿周围脑组织ATP含量明显降低（P＜0.05），且4G组明显低于2G组。说明ICH后高血糖可能加重脑组织能量代谢障碍，加重脑损伤，损伤的程度与血糖浓度有明显的关系。

NO在体内扮演着生理和病理的双重角色，脑内NO既可起脑保护作用，又可起神经细胞毒性作用。NO是由L-精氨酸在NO合酶（NOS）催化下生成的。生理量的NO可扩张血管，改善微循环及抗血小板凝聚等，但NO产生过多则会损害神经元，产生病理效应。本实验通过检测血肿周围脑组织NO含量发现，与SO组比较，脑出血3组血肿周围脑组织NO含量升高（P＜0.05）；与PCH组比较，2G组和4G组大鼠血肿周围脑组织NO含量明显升高（P＜0.05），且4G组明显高于2G组。对血肿周围脑组织NO与ATP含量进行相关性分析发现二者呈负相关，脑出血后高血糖致能量代谢障碍越重，脑组织产生一氧化氮越多，脑损伤越重。分析原因可能为（1）NO通过作用于铁蛋白产生毒性结合ADP－核糖化转移酶，使ADP糖基化，作用于铁－硫蛋白类如辅酶Q氧化还原酶、辅酶Ⅰ、琥珀酸氧化还原酶等酶系统，使细胞呼吸抑制和能量代谢障碍，导致脑损伤加重；且与血红素结合的铁蛋白如运铁素和核糖核苷酸还原酶作用，NO促进运铁素释放铁，游离铁可促进脂质过氧化而加重能量代谢障碍，进一步加重脑损伤；（2）NO与超氧自由基〔O2－〕结合可产生硝基过氧化物，引起较大的毒性，加重能量代谢障碍，加重脑损伤；（3）NO可以通过碱基的脱氨基作用导致DNA损伤，同时也直接使DNA断裂，加重能量代谢障碍，从而加重脑损伤。

1 方 煌，梅元武，李朝武，等.实验性脑出血灶周 MMP-9的表达与脑水肿的关系.卒中与神经疾病，2009，16（4）：214-217.

2 孟庆伟，郭景红，吴家幂.血红素氧合酶-1在大鼠实验性脑出血中的作用机制.卒中与神经疾病，2008，15（6）：334-336.

3 Aoki E，Yano R，Yokoyama H，et a1.Role of nuclear transcription factor kappa B（NF-kappa B）for MPTP（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahyropyridine）-induced apoptosis in nigral neurons of mice.Experimental and Molecular Pathology，2009，86（10）：57-64.

4 Xue M，Del Bigio MR.Intracerebral injection of autologous whole blood in rats：time course of inflammation and cell death.Neurosci Lett，2000，283（3）：230-232.

5 Yang GY，Betz AL，Chenevert TL，et a1 Experimental intracerebral hemorrhage：relationship between brain edema，blood flow and blood-brain barrier permeability in rats.J Neurosurg，1994，81（1）：93-102.

6 王小蓉，何晓英，李小刚.实验性脑出血高血糖与血肿周围乳酸和细胞因子关系的研究.中风与神经疾病杂志，2010，27（4）：357-359.

7 王小蓉，谭 华，彭绍忠等.大鼠脑出血后高血糖对脑损伤的实验性研究.陕西医学杂志，2009，38（4）：405-408.