延胡索总生物碱对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响*

孙世晓 杨添淞 赵伟丽 赵楠 田明

（黑龙江中医药大学·哈尔滨 150040）

前言 中药延胡索在临床应用已有上千年历史，早在《雷公炮炙论》即记载“心痛欲死，速觅延胡”，［1］。该药目前在临床上常用于治疗心肌缺血、心绞痛、心律失常、早搏等，具有显著疗效。实验资料表明，

延胡索能影响冠状动脉血流量、心肌收缩力和心肌细胞内钙离子浓度，并能减轻心肌坏死程度，改善坏死边缘区心肌的营养供血［2、3、4、5］，但在目前，针对延胡索总生物碱抗心肌细胞凋亡的研究尚未见报道，故本实验进行了相关研究，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料动物

70只健康成年Wistar大鼠，体重220±20g,雌雄各半，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK黑2008-004；仪器：PCR仪，Image-ProPlus5.0图像分析系统，GIS凝胶成像分析系统，高速冷冻离心机，动物呼吸机。药品：盐酸普萘洛尔，批号；0901209，天津力生制药股份有限公司生产；延胡索总生物碱由中药实验室自行提取，经光谱比色检测并计算其纯度达到60%，试剂：TUNEL试剂盒，rTaq酶，bax、bcl-2和caspase-3引物，B-Actin。以上试剂购于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药 随机分为7组：正常组、假手术组(只穿线不结扎)、模型组，延胡索总生物碱低剂量(0.5mg／kg)组、中剂量(1.Omg／kg)组、高剂量(2.Omg／kg)组、盐酸普萘洛组；(0.5mg／kg)组，每组10只。各组连续灌服给药14天，其中假手术组、模型组给予灌服等体积蒸馏水。

1.2.2 造模 末次灌胃1小时后，除对照组、假手术组外，其余各组通过冠状动脉结扎复制急性心肌缺血大鼠模型。

1.2.3 心脏标本采集 在冠脉结扎3小时后处死大鼠，立即取出心脏用冰盐水清洗并除掉周围大血管、左右心房、右心室及结缔组织，在心脏结扎线以下平行冠状沟将心室横断切成5片，将第2片放入4%多聚甲醛固定液中4℃固定24小时，制作石蜡切片用于TUNEL检测：第3片放入液氮中冻存，用于RTPCR检测。

1.2.4 TUNEL检测 取大鼠心肌组织石蜡切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度入水，蛋白酶K消化，0.01MPBS冲洗，0.3%H202,处理，50u1TUNEL反应混合液孵育，DAB显色，苏木素淡染，烤干后树胶封片。用光镜在200倍视野下随机取10个视野，经Image-Pro Plus5.0图像分析系统进行扫描，以染色强度计算凋亡阳性细胞百分率。

1.2.5 RT-PCR检测 取大鼠心肌组织50～lOOmg置研钵中研磨，加Trizol试剂后转移至rppendorf管中，12000rpm、4℃离心取上清液，加三氯甲烷混匀，12000rpm、4℃再次离心取水相，加异丙醇混匀，12000rpm、4℃离心后弃上清液，加无水乙醇漂洗沉淀，7500rpm、4℃离心后弃上清液，测定RNA纯度，然后配制RNA标准液并进行逆转录反应。Bcl-2上 游 引 物 为：CCCTGGCATCTTCTCCTTC，下 游 引 物 为：CATCTCCCTGTTGACGCTC；Bax上 游引物为：GAAGCTGAGCGAGTGTCTCC，下游引物为：GATCAGCTCGGGCACTTTAG；Caspase-3上 游 引 物为：TCTGACTGGAAAGCCGAAACTC， 下 游 引 物 为：ACGGGATCTGTTTCTTTGCATG。以β-actin作为内参照。用含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，GIS凝胶成像分析系统拍照并对产物条进行分析。

1.2.6 统计方法 以上结果以均数±标准差表示，统计处理用SPSS11.5软件进行。

2 结果

以上结果见表1和图1、图2、图3。

表1：延胡索总生物碱对急性心肌缺血大鼠细胞凋亡的影响(±S，n=10)

表1：延胡索总生物碱对急性心肌缺血大鼠细胞凋亡的影响(±S，n=10)

注：与正常组比较：·P

caspase-3基因相对表达量正常组 0.3±0.02 0.45±0.09 0.27±0.03 0.07±0.03假手术组 0.2±0.03 0.43±0.06 0.25±0.02 0.06±0.03模型组 13.5±0.25* 0.15±0.03* 0.52±0.07* 0.19±0.02*高剂量组 5.8±0.07#◇ 046+0.030#◇ 0.16±0.05#◇ 0.08±0.05#◇中剂量组 5.1±0.12#◇ 0.43±0.08#◇ 0.18±0.03#◇ 0.08±0.06#◇低剂量组 9.1±0.35# 0.35±0.06# 0.23±0.04# 0.12±0.02#阳性药组 5.7±0.11#◇ 0.44±0.04#◇ 0.16±0.05#◇ 0.07±0.03#◇组 别凋亡阳性细胞百分率(%)bcl基因相对表达量bax基因相对表达量

与正常组比较，模型组心肌细胞凋亡阳性率增多P<0.01；与模型组比较，延胡索总生物碱高、中、低剂量组和普萘洛尔组心肌细胞凋亡阳性率减少P

3 讨论

研究表明［6、7］，在心脏生理、病理的发展过程中，能够引起心肌细胞产生凋亡的原因多种多样，有机械刺激、细胞因子、超负荷钙离子、氧自由基、细菌毒素、缺氧等，因此，心肌细胞凋亡现象是普遍存在的。已有实验证实，急性心肌缺血也能诱发心肌细胞产生凋亡，如Saraste在研究中发现［8］，大鼠冠状动脉结扎后1h内，心肌细胞无丢失现象，结扎2h后，心肌细胞出现凋亡和坏死，细胞凋亡高峰发生在结扎5h后，细胞坏死高峰发生在结扎24h后，该结果提示大鼠冠状动脉结扎后，早期心肌损伤以凋亡为主，后期以坏死为主，说明细胞凋亡和细胞坏死在急性心肌缺血中是相互独立的。传统观念认为，急性心肌缺血所致的心机损伤主要是心肌坏死，但现在已经清楚，急性心肌缺血时还存在心肌细胞凋亡发生。心肌细胞属于终末期分化细胞，几乎无再生能力［9］，如果能设法抑制急性缺血后心肌细胞凋亡，增加存活心肌细胞数量，无疑会有利于防治心肌缺血和促进心功能的恢复，这对患者的长期预后非常有益。

目前认为，心肌细胞凋亡有两种信号转导途径［10、11］：即细胞表面死亡受体途径和线粒体死亡途径。细胞表面死亡受体途径与肿瘤坏死因子和Fas启动有关，线粒体死亡途径则是由Bcl-2家族成员激活而引起。Bcl-2家族成员分为两个亚族，即抗凋亡蛋白亚族和前凋亡蛋白亚族，前者包括Bcl-2和Bcl-xL，后者包括Bax、Bak、Bid和Bad等。在正常情况下，Bc1-2家族的大部分抗凋亡蛋白一般作为细胞器膜(如线粒体、内质网和核膜)的整合膜蛋白被隔离起来，而前凋亡蛋白则以非活性的形式定位分布于胞液中或细胞质骨架上，当有凋亡刺激时，前凋亡蛋白成员发生加工修饰，易位于线粒体外膜上，引起线粒体通透性和膜电位改变，释放细胞色素C、凋亡诱导因子等，启动半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspases)级联反应，激活Caspase-3使细胞产生凋亡。

本实验观察了延胡索总生物碱对急性心肌缺血模型大鼠心肌细胞凋亡的影响，同时观察了各组bcl-2、bax和caspase-3基因表达的变化，实验结果表明，模型组心肌细胞凋亡阳性率明显增多，延胡索总生物碱高、中、低剂量组心肌细胞凋亡阳性率明显减少，模型组bcl-2基因相对表达量减少，bax和caspase-3基因相对表达量增多，延胡索总生物碱高、中、低剂量纽bcl-2基因相对表达量增多，bax和caspase-3基因相对表达量降低。以上结果表明，延胡索总生物碱高、中、低剂量具有抗急性心肌缺血模型大鼠心肌细胞凋亡作用，该作用与调节bcl-2、bax和caspase-3基因表达有关。

［1］李时珍:本草纲目(上).人民卫生出版社，2006，555.

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［4］邱蓉丽,李祥,陈建伟,等.延胡索总生物碱抗心肌缺血作用的实验研究.中国中医药科技,2001,8(4):265.

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