聪智灵对拟血管性痴呆小鼠海马乙酰胆碱酯酶的影响*

河北医科大学中医学院(石家庄050091)

张会珍 白亚平△ 肖红玲 王鑫国 张 闯△△ 孙彦辉 吴中秋

血管性痴呆 (VD)是因脑血管因素所致的智能及认知功能障碍临床综合征。近年来，随着老龄人口不断增加，VD发病率呈现增高趋势。VD的发病机制目前尚未完全探明，现代医学尚缺乏系统有效的治疗手段，临床对VD的防治多属于对症治疗，［1］而中医药在防治脑血管病方面的优势已得到临床验证。本研究通过复制脑缺血再灌注VD小鼠模型，观察中药复方聪智灵对VD模型小鼠学习记忆能力及海马组织乙酰胆碱酯酶 (AchE)活力的影响，探讨聪智灵对VD的治疗效应及作用机制，为中医临床治疗VD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性昆明小鼠100只，体质量25 g～30 g，由河北省实验动物中心提供 (昆明小鼠二级实验动物，合格证号:612159)。

1.2 实验材料

1.2.1 药物:聪智灵由葛根、黄芪、当归尾、桃仁、红花、地龙、石菖蒲等中药组成，常规水提纯法制成1 g生药/mL，课题组自制，冰箱保存，备用。尼莫地平片由河北医科大学制药厂生产 (批号:H13022049)，实验时用蒸馏水配制成浓度为3 mg/mL的混悬液。

1.2.2 主要试剂:AchE试剂盒:南京建成生物工程研究所生产，批号:20041115。

1.2.3 主要仪器:小鼠跳台仪，中国医学科学院药物研究所;HM-200型电子天平，日本OLYMPUS公司;MSE-25型高速冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂;半自动生化仪 (Humalyzer2000)，美国。

1.3 动物分组和模型制备 将小鼠随机分为5组:假手术组、模型组、聪智灵高剂量组(简称高剂量组)、聪智灵低剂量组 (简称低剂量组)、尼莫地平组。参照文献［1］制作脑缺血再灌注拟血管性痴呆动物模型。将动物用10%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉，颈正中部常规消毒后切口，分离双侧颈总动脉，套“4”号丝线扣，拉紧丝扣，阻断血流20 min，同时在距尾尖1 cm处剪断放血约0.3 mL，热凝止血。松开丝扣使血液灌注10 min后，再次阻断血流20 min，第2次再灌后观察30 min，缝合皮肤。假手术组只分离颈总动脉，穿线但不结扎，尾部不放血，观察时间与其他组相同。术后每日肌注青霉素0.2万U，连续3 d。本实验维持动物肛温 (36±0.5)℃，防止低温对缺血所致脑损伤的保护作用。

1.4 治疗方法 术后当天动物苏醒后开始治疗。假手术组与模型组均灌服蒸馏水10 mL/kg体质量，尼莫地平组灌服尼莫地平液30 mg/kg体质量，低剂量组灌服聪智灵液29 g/kg体质量 (相当于临床成人用药量的10倍)，高剂量组灌服聪智灵液58 g/kg体质量 (相当于临床成人用药量的20倍)。各组均1次/d灌胃，连续治疗15 d。

1.5 指标检测

1.5.1 行为学检测:于造模第15 d治疗结束后进行。采用跳台实验。实验装置是一10 cm×10 cm×5 cm的小鼠跳台反应箱，分为两间，箱底为可通36 v连续电刺激的铜栅。每间右后角置一直径和高均为4.5 cm的橡皮垫，作为小鼠回避电击的安全区。实验时先将小鼠置于跳台仪中，适应环境3 min，然后底部铜栅通以交流电，记录动物受到电刺激后跳上橡皮垫的反应时间和5 min内受电击的次数 (错误次数)，作为学习成绩。24 h后将小鼠置于跳台仪中适应3 min，再将其置于橡皮垫上，记录第一次跳下橡皮垫的潜伏时间和5 min内受电击的次数 (错误次数)，作为记忆成绩。

1.5.2 海马组织AchE活力检测:行为学检测结束后在麻醉下断头处死小鼠，冰盘上快速剖取全脑，弃去嗅球及小脑。沿矢状面方向将脑组织对称切开，取右侧脑组织，分离海马并称重，按照重量和体积比1︰10的比例，加入生理盐水冰浴匀浆，4℃ 4 000 r/min离心10 min，取上清液备测，采用分光光度法检测AchE活力 (按试剂盒说明书进行检测)。

2 结果

2.1 行为学检测结果 表1示，模型组小鼠的反应时间明显延长，潜伏时间显著缩短，错误次数明显增加，与假手术组比较差异有非常显著性 (P＜0.01);各治疗组与模型组比较，反应时间缩短，潜伏时间延长，错误次数明显减少，学习成绩与记忆成绩均优于模型组，差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，其中，高剂量组学习记忆成绩均优于低剂量组和尼莫地平组 (P＜0.05或P＜0.01)。

表1 各组小鼠学习记忆能力比较(跳台法)(±s，n=10)

表1 各组小鼠学习记忆能力比较(跳台法)(±s，n=10)

注:与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;与尼莫地平组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与低剂量组比较，△P＜0.05

组别 学习成绩反应时间 (s) 错误次数 (次)记忆成绩潜伏时间 (s) 错误次数 (次)假手术组 21.24±8.48▲▲ 2.10±0.99▲▲ 247.99±51.77▲▲ 2.3±0.95▲▲模型组 63.08±14.68 7.80±2.78 81.10±36.72 7.90±2.81尼莫地平组 46.60±16.34▲▲ 5.20±2.39▲ 152.03±56.85▲▲ 5.20±2.30▲▲低剂量组 41.63±11.33▲▲ 4.80±2.66▲▲ 155.29±35.79▲▲ 5.50±2.60▲高剂量组 29.20±12.42▲▲＊＊△ 2.70±1.34▲▲＊△ 208.00±41.62▲▲＊△ 2.90±1.66▲▲＊△

2.2 AchE活性测定 表2示，模型组小鼠脑组织海马区AchE活性较假手术组明显下降 (P＜0.01)，各用药组AchE活性均显著高于模型组 (P＜0.01)，以聪智灵高剂量组优于低剂量组和尼莫地平组 (P＜0.05)。

表2 各组小鼠海马AchE活力比较(±s)

表2 各组小鼠海马AchE活力比较(±s)

注:与模型组比较，▲▲P＜0.01;与尼莫地平组比较，*P＜0.05;与低剂量组比较，△P＜0.05

组别 n AchE(U/mgprot)假手术组 10 503.6±55.24▲▲模型组 10 346.86±52.56尼莫地平组 10 441.93±78.22▲▲低剂量组 10 436.04±62.63▲▲高剂量组 10 501.56±69.94▲▲＊△

3 讨论

VD属于中医“呆病”、“善忘”、“文痴”等范畴。中医学认为，“脑为元神之府”，“脑为髓海”，髓海充实，则神清智明。VD患者多年老体弱，元气不足，不能推动血液运行，以致脑络瘀阻，气血不得濡养脑髓，以致神明失养，灵机记性失常，出现学习障碍，记忆衰退，反应呆钝等症。正如《医林改错》所云:“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀。”可见VD为本虚标实之证，正气不足为本，瘀阻脑络为标。课题组结合临床经验，筛选具有益气活血、祛瘀通络、醒神开窍的葛根、黄芪、当归尾、桃仁、红花、地龙、石菖蒲等药物组合成复方聪智灵。本方仿补阳还五汤重用生黄芪，以其大补元气，意在气旺以促血行，祛瘀而不伤正，且气味俱轻，具有升发之性，对脑气不足、九窍不通者，黄芪实为上品;配以当归尾、桃仁、红花等药活血祛瘀;地龙通经活络;石菖蒲醒神开窍，健脑益智;葛根升举清阳之气，有利元气上充于脑，并有活血祛瘀之功(《本草拾遗》载“升者破血”)。诸药合用，可使气旺血行，瘀祛络通，脑髓得养，灵机记性渐归于常。现代研究证实，益气活血中药可明显改善VD模型的学习记忆功能，［3-5］具有显著的抗VD作用;石菖蒲所含挥发油具有抑制神经细胞凋亡的作用，对痴呆模型动物学习记忆及认知功能有显著改善作用;［6-7］葛根素能促进脑源性神经营养因子表达，减少神经细胞丢失，可明显改善VD大鼠的学习记忆障碍。［8］

海马是学习记忆功能非常重要的脑区。研究证实，海马直接参与了信息贮存和回忆，是缺血损伤最敏感的脑区。［9］近年来，在痴呆发病机理中，中枢胆碱能系统的作用逐渐被认识，中枢胆碱能通路是学习记忆的主要通路，研究表明，VD的形成与中枢胆碱能系统的受损有关。乙酰胆碱 (acetyl-choline，Ach)为中枢胆碱能系统的重要神经递质，与学习、记忆等功能有密切联系。Ach由胆碱乙酰转移酶 (ChAT)合成，被胆碱酯酶 (AchE)分解，通过Ach受体而发挥生物学效应。如果ChAT和AchE的活性异常，将会引起Ach代谢失调，致使中枢胆碱能系统的生化改变。AchE作为Ach的水解酶，其活力变化可间接反映乙酰胆碱的含量和代谢情况。AchE是生物神经传导中的关键性酶，该酶降解Ach，当AchE活力降低时，减弱了对乙酰胆碱的降解作用，致突触间隙的乙酰胆碱浓度增高，使突触后效应增强，提高了谷氨酸神经兴奋毒性作用。［10］至于VD海马区AchE活性下降的可能原因［11］是:由于脑组织缺血缺氧，使三羧酸循环障碍，提供酶生物合成时所需要的原料和能量减少;AchE分布于胆碱能神经元上，缺血再灌注损伤了海马的胆碱能神经元，致突触数量减少，ChAT活性降低，Ach生成减少，AchE的活性相应下调。

本实验采用双侧颈总动脉缺血再灌注复制VD模型，行为学检测结果显示，模型组小鼠学习和记忆成绩均较假手术组显著降低 (P＜0.01)，表明模型组学习和记忆能力障碍;益气活血复方聪智灵与尼莫地平均可提高模型小鼠的学习记忆能力，表明聪智灵与尼莫地平均具有改善VD模型小鼠认知障碍的作用，尤以聪智灵高剂量组作用明显。AchE检测结果显示，模型组海马组织AchE活性显著低于假手术组 (P＜0.01)，各用药组AchE活性均显著高于模型组 (P＜0.01)，提示脑缺血再灌注时胆碱能神经元受损，AchE活性下降;中药复方聪智灵能提高海马区AchE活性，表明聪智灵减轻了缺血再灌注对海马区胆碱能神经元的损伤，且表现出量效关系。综上，聪智灵改善VD模型小鼠学习记忆功能的机制，可能与减轻脑缺血再灌注对海马神经元损伤，提高海马组织内AchE活性有关。

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