大孔吸附树脂纯化黄连总生物碱工艺研究

吕子明 刘文娟 王 永 刘晓燕 梁俊清 屠鹏飞

1.北京大学药学院 天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100191；2.北京以岭药业有限公司，北京 100027

黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao、云连 Coptis teeta Wall.等的干燥块茎，具有清热燥湿、泻火解毒之功效[1]。黄连中的小檗碱、巴马亭、黄连碱、小檗碱等生物碱是其发挥药效的主要物质基础。本实验旨在优选出一种适合分离黄连总生物碱的大孔树脂，并对优选出的大孔树脂分离黄连总生物碱时的工艺条件及参数进行研究。

1 仪器与材料

UV-2550紫外分光光度计（日本岛津公司）；Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Sartorius BS 110电子天平；黄连（购于河北省安国以岭饮片有限公司，经鉴定，符合《中国药典》2010年版一部标准，产地：四川，批号：070401）；小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110713-200208）；大孔吸附树脂 S-8、DM130（三星树脂科技有限责任公司），HPD-600、HPD-400A、HPD-700、AB-8、D101（沧州宝恩吸附材料科技有限公司），D141、D4020（天津市波鸿建材化工树脂有限公司），其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 上柱药液的制备

按文献[2]中优化好的提取工艺进行提取。取黄连饮片适量，加50%乙醇，溶剂用量8倍，提取3次，每次1.5 h。合并提取液，减压浓缩至无醇味，加水定容至2 500 mL，抽滤，备用，即每毫升药液相当于含30 mg生药材。

2.2 含量测定

2.2.1 总生物碱的含量测定 依据文献[2]，采用紫外分光光度法进行。

2.2.2 小檗碱的含量测定[2]依据文献[2]，采用高效液相法进行。色谱条件：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，0.5 μm）；流动相：乙腈-磷酸水溶液缓冲盐[磷酸-三乙胺-水（1∶2∶100）]（24∶76）；柱温：室温；流速：1.0 mL/min；检测波长：345 nm；进样量：5 μL。

2.3 大孔吸附树脂的预处理

取各型号树脂于95%乙醇漂洗干净，浸泡24 h后，湿法装柱，并用95%乙醇动态洗脱5倍树脂体积，水洗至无醇味，依次用5%盐酸（浸泡6 h后，水洗至中性）和5%氢氧化钠（浸泡6 h后，水洗至中性）处理，最后用95%乙醇动态洗脱至流出液加水（体积比1∶5）不变混浊为止，用水置换出乙醇后备用。

2.4 大孔吸附树脂的筛选

分别量取25 mL各种树脂，径高比=1∶10，上样浓度为30 mg/mL（药材量/水液量），上样流速为3 BV/h。检测方法：按照文献[1]中黄连药材标准“鉴别”项下TLC法检测漏液点，每5 mL流出液检测一次，记录上样量，确定上样终点。S-8、HPD-600、HPD-400A、DM130、D141、AB-8、HPD-700、D101、D4020型树脂的上液量分别为10、35、100、90、175、140、120、130、110 mL。结果表明，弱极性（HPD-400A、DM130）和非极性树脂（D141、AB-8、HPD-700、D101、D4020）用于黄连总生物碱的吸附效果较好，极性树脂吸附效果差（S-8、HPD-600）； 因此选择吸附量较高的 D-141、AB-8、HPD-700、D1014型树脂进一步试验。

对选出的 D-141、AB-8、HPD-700、D101 四个型号的树脂进行考察。考察方法：采用动态法试验，饱和吸附上样；树脂用量 25 mL，径高比=1∶10；上样浓度 30 mg/mL，吸附流速2 BV/h；上样完毕后用2倍水洗柱；用70%乙醇（预试验选定）作洗脱液，洗脱10倍量柱体积，洗脱的流速均为2 BV/h。收集各70%乙醇洗脱液、各吸附流出液、水洗液。

测定及分析结果显示，测定上样液、过柱后的流出液、70%醇洗脱液及水液中的总生物碱和小檗碱的含量，计算出各树脂的最大吸附量及最大洗脱量，从而选出最佳树脂，结果见表1。

表1 树脂型号筛选结果

由表1结果表明，D-141的饱和吸附量最高，除D-141的洗脱率稍低外，其他3种树脂的洗脱率差异无统计学意义，因此选用D-141为纯化树脂。

2.5 吸附过程参数考察

2.5.1 上样浓度的考察 将不同浓度的样品溶液（60、40、30、15 mg/mL）分别通过湿体积为25 mL的D-141树脂柱，以2 BV/h的流速进行动态吸附。按照文献[1]中黄连药材标准“鉴别”项下TLC法检测漏液点，每5 mL流出液检测1次，记录上样量，确定上样终点。结果上样体积分别为75、140、165、250 mL； 总生物碱吸附量分别为 444.38、541.80、540.54、381.75 mg。由结果可知，当上样浓度大于40或小于30 mg/mL时树脂的吸附量变低，在30～40 mg/mL范内吸附量大，因此确定此范围为上样液浓度范围。

2.5.2 吸附流速考察 选取 4个吸附速度， 即1、2、3、4 BV/h进行考察。考察方法：上样浓度30 mg/mL，其他同上样浓度考察试验。结果测定及分析同“2.5.1”项下内容。结果是上样体积分别为 175、175、175、165 mL。 结果表明，1、2、3、4 BV/h四个上样速度下的树脂吸附量相同，差别无显著性。从吸附量稳定性及较短吸附时间的角度考虑，选择2 BV/h的吸附速度上样。

2.6 洗脱过程各参数考察

2.6.1 水洗（除杂）体积考察 进行三根柱平行试验，按上述试验确定的条件进行上样和吸附；三根柱的水洗体积分别为1、2、3倍的柱体积，水洗流速为3 BV/h。测定上样液、各水洗液中的总生物碱量，及上样液和各水洗液的烘干后的干膏重；计算各倍数水洗液中的总生物碱量占上样液总生物碱量的百分比，及水洗液中的总生物碱量占各自水洗干膏重的百分比。结果表明，3倍水洗时洗下的生物碱量大，除杂液中的生物碱含量超过了50%，而2倍水洗流失的生物碱量低，除杂液中的生物碱含量低于30%，因此选择2倍水洗除杂。

2.6.2 洗脱乙醇浓度的考察 对 20%、30%、40%、50%、60%、70%六种乙醇浓度进行了考察。考察方法：平行进行6根柱的吸附洗脱；树脂用量及径高比同上样浓度试验；吸附、水洗工艺按优选工艺参数进行；醇洗速度为3 BV/h，醇洗体积为10倍柱体积。收集各醇洗液于500 mL量瓶中，加洗脱醇稀释至刻度，摇匀。测定及分析结果显示，测定各洗脱液中及上样液的小檗碱含量、总生物碱含量及各洗脱液的干膏重，计算小檗碱、生物碱的洗脱收率及总生物碱在洗脱液干膏中的重量百分比。见表2。

小檗碱洗脱百分率=洗脱液中小檗碱的量/上样液的小檗碱量×100%。

表2 洗脱乙醇浓度考察结果

干膏中生物碱百分含量=洗脱液中总生物碱的量/各洗脱液的干膏量×100%。

由表2结果可知，40%、50%两浓度乙醇对总生物碱、小檗碱的洗脱率高，洗脱液的纯度也适宜，选择50%的乙醇为洗脱溶媒。

2.6.3 洗脱溶剂用量的考察

对4、6、8、10、12倍柱体积的50%乙醇用量进行了考察。考察方法：树脂用量及径高比同上样浓度试验；吸附、水洗工艺按优选工艺参数进行；醇洗速度为3 BV/h，进行12倍柱体积的洗脱，依次收集4、6、8、10、12倍时的洗脱液。结果测定及分析：测定各洗脱液中及上样液的总生物碱含量，计算各洗脱液中的生物碱占上样总生物碱的百分比，结果分别为93.15%、0.50%、0.14%、0.04%、0.02%。 由结果可知，4倍量50%乙醇洗脱可洗脱93%的上样量，而后边的2倍仅洗掉的量仅为0.5%，且后边的8、10、12倍的洗脱量均依次递减。因此选择4倍柱体积洗脱。

2.6.4 洗脱流速的考察 对2、3、4 BV/h的流速进行考察。平行进行3根柱的吸附洗脱；树脂用量及径高比同上样浓度试验；吸附、水洗工艺按优选工艺参数进行；醇洗速度为依次为设定的3个流速，洗脱体积为4 BV，分别收集3种流速的洗脱液。结果测定及分析：测定各洗脱液中及上样液的总生物碱含量，计算各洗脱液中的生物碱占上样总生物碱的百分比，结果分别为见93.58%、93.39%、91.90%。由结果可知，2、3倍的洗脱流速时生物碱洗脱百分率较高，4倍稍低，从保证洗脱效果和缩短洗脱时间的角度考虑，选择3 BV/h的洗脱流速。

2.6.5 径高比考察 选择 1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 四种径高比的树脂柱进行考察。吸附、水洗、洗脱过程均按优选的工艺参数进行，收集各洗脱液。测定各洗脱液中及上样液的总生物碱含量，计算各洗脱液中的生物碱占上样总生物碱的百分比，结果分别为93.09%、94.53%、94.22%、95.87%。表明，随着径高比的变大，洗脱率有增大的趋势，但差别不是很大，考虑生产上方便实用的原则，选择适宜的径高比为1∶8。

2.7 树脂使用次数考察

具体的考察方法为每次的纯化洗脱过程按纯化工艺考察优化好的吸附、洗脱方法进行。树脂用量为30 mL，收集各洗脱液。树脂首次处理方法同“2.3”项，每次洗脱完毕后的树脂处理方法为50%乙醇洗脱8倍体积，再用95%乙醇洗脱4倍体积。进行了10次试验。结果测定及分析：测定上柱液、各次洗脱液中的总生物碱量，计算洗脱百分比。结果洗脱百分比分 别 95.21% 、95.29% 、95.62% 、96.78% 、95.38% 、95.46% 、94.96%、95.29、95.08、95.13%。树脂重复使用 10 次，吸附、洗脱性能未有降低，说明树脂应用于本品的纯化具良好的耐用性。

2.8 验证试验

按上述所确定的吸附和洗脱条件，即平行制备3批样品，测定总生物碱和小檗碱的解吸率以及总生物碱含量。总生物碱的解吸率分别为94.44%、94.76%、93.56%；小檗碱的解吸率分别为92.86%、93.48%、92.43%。醇洗物中总生物碱的含量为67.67%、68.01%、67.45%，平均值为67.71%。说明所得工艺稳定、可行。

3 讨论

现有文献报道多采用酸沉法纯化黄连总生物碱，但是此方法在实际生产操作中对人体和环境有较大影响。近些年来，大孔树脂在中草药化学成分纯化得到了广泛的应用。作者在参考多篇文献[3-8]的基础上，进行了本文的实验完善。确定大孔吸附树脂纯化黄连总生物碱的工艺即：选择D-141大孔吸附树脂，上样药液浓度为30 mg药材/mL，径高比为1∶8，吸附流速为2 BV/h，除杂溶剂为水，除杂体积为2 BV，除杂流速为1 BV/h，洗脱溶剂为50%乙醇，洗脱体积为4 BV，洗脱流速为3 BV/h。该工艺合理、可行，适合工业生产。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：285-286.

[2]吕子明，于向红，屠鹏飞.正交试验优选黄连总生物碱的提取工艺[J].中国保健营养：临床医学学刊，2011，（10）：45-48.

[3]侯世祥，朱浩，孙毅毅，等.影响大孔吸附树脂吸附纯化黄连提取液因素的初步考察[J].中国中药杂志，2000，25（11）：666-668.

[4]段芳，孟江，周毅生，等.黄连中生物碱有效部位纯化工艺研究[J].中国药师，2009，12（4）：429-431.

[5]徐晓宏，张铁军，廖茂梁，等.大孔吸附树脂分离纯化黄连总生物碱的工艺研究[J].中草药，2007，38（8）：1167-1170.

[6]席国萍，宋国斌.大孔吸附树脂分离纯化黄连小檗碱研究[J].中国医药导报，2011，8（5）：44-46.

[7]张英，李卫民，高英.大孔树脂分离纯化黄连总生物碱型号的筛选[J].广州中医药大学学报，2010，27（1）：49-52.

[8]许沛虎，高媛，张雪琼.大孔树脂纯化黄连总生物碱的研究[J].中成药，2009，31（3）：390-393.