星点设计—响应面法优选大黄中大黄酸的提取工艺

齐海峰，陈维静

（辽宁修正生物制药有限公司，本溪117000）

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.唐古特大黄Rheumtangguticum Maxim.Ex balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎，具有泻热通肠，凉血解毒，逐瘀通经等功效。临床上常用于实热便秘，积滞腹痛，泻痢不爽，湿热黄疸，血热吐衄等证的治疗[1]。蒽醌类化合物是大黄的主要有效部位，包括大黄酸等5个游离蒽醌。研究发现大黄酸具有保肝[2-3]、抗纤维化、抗氧化、抗炎和抗肿瘤等作用[4]，有很重要的临床药用价值，为研究的热点。

大黄的提取最常用的优化方法是正交设计法[5]和均匀设计法[6]，但是这两种方法存在一定的不足。星点设计—效应面法作为优选工艺的方法之一，弥补了正交设计法和均匀设计法的缺限，在国内广泛运用[7-8]。星点设计采用线性或非线性拟合的实验设计方法，可以减少试验次数，并且提高了试验的精密度。响应面分析法是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间函数关系的一种统计方法，通过对响应面等值线的分析以寻求最优工艺参数。实验以大黄酸的含量为指标，采用3因素5水平的星点设计表安排提取工艺实验，结合响应面法优选大黄的提取工艺，为其开发提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国Waters高效液相色谱仪（2695溶剂管理系统，2996二极管阵列检测器，美国Waters柱温箱，Empower2工作站）；PTHW型电子恒温电热套（河南予华仪器有限公司）；FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；DZG6050SA真空干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；KQ-50B超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药

大黄酸对照品（0757-200206）（中国药品生物制品检定所），大黄药材购于哈药集团世一堂饮片厂，经检验，符合《中国药典》2010年版一部规定。水为娃哈哈纯净水。甲醇色谱纯（天津四友试剂厂），其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 大黄酸含量测定方法[1]

2.1.1 色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×150mm，5μm）；柱温：30℃；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；流速为1mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量：10μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取大黄酸对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，制成浓度为0.175mg·mL-1的溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约0.1 g，精密称定，置50mL锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置50mL圆底烧瓶中，挥去甲醇，残渣加2.5 moL·L-1硫酸溶液20 mL，置水浴中加热回流2 h，放冷，加氯仿20mL，回流30min，转移至分液漏斗中，分取氯仿液，滤过，酸液再加氯仿提取3次，每次20mL，分别滤过氯仿液，最后用氯仿10mL分次洗涤滤器，合并氯仿液和洗液，加水30mL洗涤氯仿液，弃去水洗液，氯仿液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，并转移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）过滤，取续滤液，即得。

2.2 星点试验设计

根据工业化生产的实际，实验采用乙醇回流提取法。实验中提取次数和药材粒径为非连续变量，回归处理困难，因此本试验固定提取次数为2次，药材粒径以通过3号筛为准。根据预试验结果，选择乙醇浓度（X1）、料液比（X2）和提取时间（X3）3个因素为自变量，每个因素确定5个水平，共20个试验点（6个中心点），以大黄酸含量作因变量考察指标，采用星点设计提取工艺条件，运用响应面分析法分析以寻求最优工艺参数，因素水平编码见表1，试验安排和结果见表2。

表1 提取工艺因素水平编码Table1 Factors and levels of response surface methodology test

表2 星点试验设计与结果Table2 Results of response surface methodology test

续表2 星点试验设计与结果Continued Table2 Results of response surface methodology test

2.3 数据分析

应用Design-Expert7.0软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到乙醇浓度（X1）、料液比（X2）及提取时间（X3）与大黄酸含量之间的二次多项回归方程，回归方程为:

回归方程系数 r2=0.9459（r=0.9725），说明模型能解释97.25%响应值的变化，表明该回归模型的拟合情况良好，回归方程的代表性较好，能准确预测实际情况。其校正决定系数（adj-R2）为0.8973（r=0.9472），表明此模型能解释94.87%效应值变化，因此该模型拟合程度良好。

对上述回归模型进行显著性检验，结果见表3。表3回归方程显著性检验P＜0.0001，回归方程显著性检验表明，一次项乙醇浓度（X1）和料液比（X2）对大黄酸含量的线性效应极显著（P＜0.001）；一次项提取时间（X3），二次项中对大黄酸含量的曲面效应高度显著（P＜0.01）；一次项提取时间（X3）和二次项中X12对大黄酸含量的线性效应显著（P＜0.05）；乙醇浓度（X1）和料液比（X2）交互项（X1X2）、乙醇浓度（X1）和提取时间（X3）交互项（X1X3）、料液比（X2）和提取时间（X3）交互项（X2X3）的 P 值均大于 0.05，说明各因素间的交互作用不显著。

表3 回归模型方差分析Table3 Varianceanaly sisresults of rhein

2.4 响应面分析及最优提取条件的确定

依据回归方程，在保持1个因素编码值为0时，借助Design-Expert 7.0软件绘制其他2个因素与响应值关系的三维响应面图，结果见图1～图3。由图可以看出乙醇浓度（X1）和料液比（X2），乙醇浓度（X1）和提取时间（X3）及料液比（X2）和提取时间（X3）对大黄酸含量的提取影响较为显著，且响应曲面陡峭。

图1 乙醇浓度和料液比对大黄酸含量影响的响应面图Fig.1 Response surface plot of the effects of ethanol fraction and solid-liquid ratio on the yield rate of rhein

图2 乙醇浓度和提取时间对大黄酸含量影响的响应面图Fig.2 Response surface plotof the effects of ethanol fraction and extraction time on the yield rate of rhein

为确定这三个影响因素的最佳取值，通过Design-Expert 7.0软件分析，得出回归模型存在最大值点，（X）的代码值分别为1.08，1.28，0.77，与之对应的实测值乙醇浓度（X1）为82.84%，料液比（X2）为1∶15.04，提取时间（X3）为2.73 h，此时大黄中大黄酸含量的最大估计值为2.04mg·g-1。

图3 料液比和提取时间对大黄酸含量影响的响应面图Fig.2 Response surface plotof the effects of solid-liquid ratio and extraction time on the yield rate of rhein

2.5 模型的验证

为了验证此提取模型方程的适用性，在乙醇浓度、料液比、提取时间最优的水平上，重复试验3次，提取物总含量为2.02mg·g-1（RSD为0.21%），与预测值2.04 mg·g-1吻合极好，说明用此模型指导实践具有非常好的效果。

3 结论

由于星点设计—响应面优化法采用非线性模型拟合，在中心点进行重复性实验的次数越多，越可以提高实验的精确度，预测值越接近真实值，所以实验采用6次重复试验。实验方法简便合理、稳定，可预测性较优。

试验采用响应面分析法确定了星点设计优化的大黄中大黄酸提取工艺的最优条件：乙醇浓度（X1）为82.84%，料液比（X2）为1∶15.04，提取时间（X3）为2.73 h，在此条件下，大黄中大黄酸含量的最大估计值为2.04mg·g-1，试验结果与模型预测值相符。

[1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京:中国医药科技出版社，2010:22.

[2]郭美姿，徐海荣，李孝生.大黄酸对小鼠急性肝损伤的影响[J].中医药研究，2002，18（1）:37-38.

[3]郭美姿，李孝生，沈鼎明，等.大黄酸对大鼠肝纤维化形成的影响[J].中华肝脏病杂志，2003，11（1）:26-29.

[4]刘彦珠，罗国安.大黄素和大黄酸对平滑肌细胞增殖作用研究[J].生物物理学报，1998，14（2）:240-243.

[5]杨晶晶，张苏阳，韩泳平.正交法优化大黄中大黄酸的提取工艺的研究[J].西南民族大学学报:自然科学版，2010，36（3）:418-420.

[6]廖国平，贺帅，张忠义.均匀设计法优选大黄酸提取工艺研究[J].安徽农业科学，2010，39（22）:13415-13416.

[7]徐金龙，张红梅，徐秀泉.响应面分析法优化牡丹皮中总黄酮的提取工艺[J].中国药房，2011，22（27）:2536-2538.

[8]徐金龙，张红梅，徐秀泉.响应面设计法优化牡丹皮中总酚的提取工艺[J].安徽农业科学，2010，38（34）:19295-19297.