丁草胺降解菌P10的分离鉴定及其对植株修复效果的研究

彭亚军，程小梅，王俊华，李 欣，蔡海林，周小毛，柏连阳,2

（1.湖南农业大学农药研究所，湖南 长沙 410128；2.湖南人文科技学院，湖南 娄底 417000）

丁草胺是一种高效内吸传导型苯乙酰胺类芽前除草剂，对以种子萌发的杂草有很好的防除效果。由于其性质稳定，土壤中丁草胺的降解主要是由微生物完成的[1-4]，所以筛选丁草胺高效降解菌的意义重大。目前，已筛选出很多丁草胺高效降解菌[5-6]，但还未见利用降解菌来修复丁草胺药害植株的相关报道。笔者通过室内盆栽试验研究了丁草胺降解菌P10对丁草胺药害植株的修复效果，为丁草胺污染的生物治理提供了一条有效途径。

1 材料与方法

1.1 供试原药及培养基

土样采自有长期生产丁草胺经历的江苏常隆化工有限公司。

供试药剂为95%的丁草胺原药（安徽丰乐农化有限责任公司）。

基 础 盐 培 养 基 ：K2HPO41 g，KH2PO41 g，NH4NO31 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，微量元素液1 mL，蒸馏水1 000 mL，pH值7.2~7.4。

半固体基础盐培养基：在基础盐培养基中加入0.4%的琼脂粉。

LB培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 值 7.0~7.2。

1.2 丁草胺降解菌的富集和分离

在含50 mg/L丁草胺的基础盐液体培养基中加入5 g采集的土样，于30℃恒温摇床中黑暗振荡培养，振荡频率为150 r/min；每隔1周以5%（体积分数）的接种量转接到新鲜培养基中，并逐步提高丁草胺浓度，至培养液中丁草胺浓度达到200 mg/L，如此驯化约1个月。于丁草胺LB培养基上划线分离，选取长势好的菌落纯化3次，得到纯化的丁草胺降解细菌。将纯化好的细菌回接至丁草胺基础盐培养基中，取0 h、7 d样各1 mL，10 000 r/min离心5 min后过0.45 μm的水相滤膜进液相色谱检测。

1.3 液相色谱检测条件

色谱柱：Kromasil 100-5C18 柱（5 μm）4.6 mm×150 mm；检测波长：215 nm[7]；流动相：乙腈∶水=75∶25；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

1.4 菌株P10的鉴定

菌株P10的形态以及生理生化鉴定参照东秀珠等的方法[8]。P10的16S rDNA序列测定：采用细菌的16S rDNA通用引物，以细菌的总DNA为模板，对菌株的16S rDNA进行PCR扩增；PCR产物用GENEray胶回收试剂盒进行回收，将回收产物克隆到pEASY-T1载体上，转化Top10感受态细胞，以氨苄青霉素为筛选剂进行筛选；挑取阳性克隆斑，进行PCR验证，同时用碱法提取质粒进行测序；用BLAST分析序列的同源性，采用MEGA 5.05软件构建系统发育树。

16S rDNA 通用引物为：上游，5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′；下游，5′-GGTTACCTTCTTACG ACTT-3′。反应体系（25 μL）为：10×EX-Taq buffer 2.5 μL，dNTP mix 2 μL，16S rDNA 上、下游引物各0.4 μL，EX-Taq 酶 0.2 μL，总 DNA 模板 1 μL，ddH2O 18.5 μL。 PCR反应条件为：94℃预变性 6 min，94℃变性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 3 min，扩增32个循环，72℃后延伸10 min。

1.5 菌株P10修复药害植株试验

处理1：半固体基础盐培养基灭菌后倒150 mL于250 mL烧杯中；处理2：半固体基础盐培养基灭菌稍放冷后，加入丁草胺储备液，浓度为20 mg/L，倒150 mL于250 mL烧杯中；处理3：半固体基础盐培养基灭菌稍放冷后，加入丁草胺储备液，浓度为20 mg/L，冷却到50℃左右后加入10%经基础盐培养基活化一周的P10培养液，倒150 mL于250 mL烧杯中。待凝固后播种经清水浸种、催芽，且萌发一致的水稻种子，每盆20粒，每个处理3个重复。于28℃，16 h光照、8 h黑暗培养10 d后观察，记录出苗个数、株高、株鲜重，50℃烘干至恒重后，称取株干重。

2 结果与分析

2.1 丁草胺降解菌P10的筛选

富集、纯化后，筛选出一株丁草胺高效降解细菌P10，P10在 30℃、150 r/min黑暗摇床培养 7 d，能降解培养液中89.6%的丁草胺，所测降解液相图谱见图1，液相图谱峰面积和丁草胺的浓度成正比，A为0 h取样的检测图谱，B为只加丁草胺的空白样7 d后取样的检测图谱，C为加有降解菌P10的处理样7 d后取样的检测图谱。

2.2 菌株鉴定

图1 P10 7 d对丁草胺的降解液相图谱（A：0 h；B：空白；C：P10）

P10在LB平板上30℃培养1 d后，菌落呈乳白色，圆形、隆起、不透明，图2为菌体在电镜下的形态。通过理化性质检测发现：菌株P10与接触酶、葡萄糖、甲基红、V-P[检测某种细菌分解碳水化合物产生乙酰甲基甲醇CH3CH（OH）COCH3的反应]、脲酶等反应呈阳性；与氧化酶、H2S产生、明胶液化、淀粉水解等呈阴性。抗药性检测的结果表明：P10对硫酸卡那霉素（20 mg/L）、硫酸链霉素（20 mg/L）和硫酸新霉素（20 U/mL）敏感；而对氨苄青霉素（20 mg/L）和氯霉素（20 mg/L）不敏感。菌株P10和相关菌株的16S rDNA序列构建的系统发育树结果表明：菌株P10与 Klebsiella ornithinolytica（AJ251467.1）及Klebsiella sp.R-21934（AJ786796.1）的相似性均为99%，并且与它们共同组成一个分支，再结合P10的理化特征将其鉴定为克雷白氏杆菌属（klebsiella sp.）（图 3）。

图2 P10的电镜照片

图3 P10菌株的系统发育树

2.3 菌株P10修复药害植株试验结果

从室内药害植株修复试验结果来看，施加降解菌P10后对水稻的出苗率、株高及株重均有明显影响（见表1），当盆栽中丁草胺浓度为20 mg/L，接菌量为10%时，水稻的出苗率、株高、株鲜重和株干重分别比空白组处理1低44%、60%、49%和55%；但是比含同样浓度丁草胺、未接菌对照组处理2分别高129%、208%、178%和123%。降解菌株P10对丁草胺药害水稻的出苗率和株鲜重均有极显著的修复效果，对株高和株干重有显著的修复效果。这说明在室内条件下，降解菌能够促进残留丁草胺的降解，减轻其对水稻的药害。

表1 菌株P10施用后对水稻生长指标的影响

3 讨论

因为丁草胺长期大面积的使用，给环境带来了很严重的危害，所以解决丁草胺危害问题迫在眉睫。利用高效降解菌消除除草剂残留有运行成本低、无二次污染等优势，发展前景非常好，故应对利用微生物降解除草剂这一课题进行更多、更深层次的研究。

该研究筛选出的降解细菌P10被鉴定属于克雷白氏杆菌属，和已报道的丁草胺降解菌为不同属，扩大了微生物治理的选择范围。有关该菌降解丁草胺的途经将在后续工作中进一步研究。

目前微生物修复丁草胺药害植株的研究还未见报道，通过室内盆栽发现所筛选的丁草胺高效降解菌株对丁草胺药害水稻植株的出苗率、株高以及株鲜、干重都有很好的修复效果，这为将来室外田间丁草胺药害的修复提供了很好的指导作用。

[1]Beetman G B，Deming D M.Dissipation of Acetanilide Herbicides from Soils[J].Agronomy Journal，1974，66（2）：308-311.

[2]俞康宁，戚澄九，唐 柯.稻田环境与除草剂去草胺降解速率的关系[J].环境科学学报，1993，13（2）：169-173.

[3]陈忠孝，樊德方.丁草胺在土壤中渗漏、残留与降解的动态研究[J].环境化学，1988，7（2）：30-36.

[4]Moon，Young Hee.Effects of Heavy Metals on the Degradation of Fenitrothion，IBP（ Iprobenfos）and Butachlor in Flooded Soils[J].Han Guk Nonghwa Hakhoeshi，1990，33（2）：138-142.

[5]李春艳，李艳春，成小松，等.一株丁草胺降解菌的分离鉴定及培养条件优化[J].环境科学学报，2010，30（2）：347-353.

[6]吴新杰，岳永德，花日茂，等.丁草胺高效降解细菌的分离[J]，应用与环境生物学报，2000，6（6）：593-596.

[7]赵淑莉，谭文捷，何绪文.除草剂丁草胺的分析测定及其微生物降解产物研究[J].农业环境科学学报，2005，24（5）：989-993.

[8]东秀珠，蔡妙英，等.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.