冷冻离心法纯化黄芪提取液的工艺研究

李航, 李小芳, 李娜

黄芪为实验室自组处方“肠康宁”中的一味药物，主要以黄芪中的皂苷和多糖作为指标成分。在以微波提取法考查黄芪药材的提取工艺中，测得黄芪提取液的浸膏得率为43 %左右，浸膏得率太大，对本课题的后续成型工艺造成不便，需进行纯化处理。

现有纯化工艺，一般是对提取液进行醇沉处理[1~2]，此方法虽然具有澄清药液、减少服用量等优点，但也存在乙醇耗量大、工艺复杂、成本较高等缺点，并且把本方中的有效成分-多糖作为杂质除去。将离心分离技术应用于中药提取液的纯化，能基本解决醇沉法易造成的有效成分丢失、水提浸膏分离纯化困难等问题[3]，也能明显改善分离液的澄明度，有利于提高药效，减少服用剂量，增加制剂的稳定性及产品的质量等优点。

基于上述原因，本试验采用冷冻离心技术来优化黄芪提取液的纯化工艺。

1 仪器和试药

1.1 仪器

GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；HWC-3型微波提取实验设备（天水华圆医疗设备有限公司）；UV-6000型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；DZG-6020型真空干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；BP211D型电子天平（十万分之一，德国Sartorius）；UPT-I-10T型超纯水器（成都超纯科技有限公司）；恒温水浴锅（金坛市鸿科仪器厂）；各型号移液枪。

1.2 试药

黄芪药材（购自成都荷花池中药材市场，经成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定为正品）；黄芪提取液（实验室自制）；黄芪甲苷对照品（批号110781-200613；中国药品生物制品检定所提供）；D-无水葡萄糖对照品(批号l10833-200302，供含量测定用；中国药品生物制品检定所提供)。5%苯酚溶液；5 %香草醛-冰醋酸溶液；浓硫酸、高氯酸、氨水、苯酚、冰醋酸、香草醛等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芪提取液的制备

依据“星点设计-效应面法优化黄芪的微波提取工艺”中得出的最优工艺制备黄芪提取液：取60 g过2号筛的黄芪药粉、微波功率650 W、共提取3次、第1次加70%乙醇溶液948 mL提取25 min、第2次加70%乙醇840 mL提取25 min、第3次加840 mL的蒸馏水提取35 min；前2次提取液浓缩到一定程度后，加入第3次提取液，浓缩，定容到100 mL容量瓶，即得0.6 g生药﹒mL-1的提取液。经相应实验测得提取液中黄芪皂苷的含量为10.9631 mg﹒g-1、黄芪多糖的含量为257.6107 mg﹒g-1、浸膏得率为42.57%。

2.2 单因素考查

经查阅相关文献发现，鲜有系统介绍离心技术用于纯化中药提取液的报道，所以本试验首先对提取液浓度、离心温度、离心时间、离心转速进行单因素考查，确定各因素的较佳取值范围，而后根据各因素的最佳取值范围，以浸膏得率为指标性成分，进行4因素3水平的正交试验设计。

2.2.1 提取液浓度对浸膏得率的影响 本单因素试验共考查了6种提取液浓度，分别为：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g生药﹒mL-1，其中0.1~0.5 g生药﹒mL-1为0.6 g生药﹒mL-1提取液稀释到相应浓度所得，实验结果如图1所示。

图 1 提取液浓度对浸膏得率的影响

由图1 可知，随着提取液浓度的增大，浸膏得率呈减小趋势；0.5 g生药﹒mL-1和0.6 g生药﹒mL-1的浸膏得率相差不大。

2.2.2 离心温度对浸膏得率的影响 本单因素试验共考查了6个梯度范围，他们分别为：-5 ℃~0 ℃、0 ℃~5 ℃、6 ℃~10 ℃、11 ℃~15 ℃、16 ℃~20 ℃、20 ℃~30 ℃。所得实验结果如图2所示。

图2 离心温度对浸膏得率的影响

由图2 所知：随着温度升高，浸膏得率呈逐渐增大的趋势；6℃~10℃和11℃~15℃之间，浸膏得率增幅较大，16℃~20℃和20℃~30℃相比，浸膏得率变化不明显。

2.2.3 离心时间对浸膏得率的影响 此单因素试验共考查了7个时间梯度，它们分别为：10、20、30、40、50、60、90 min。所得实验结果如图3所示。

图 3 离心时间对浸膏得率的影响

由图3可知：随着离心时间的延长，浸膏得率呈渐小趋势；10 min和20 min之间浸膏得率减幅较大，20 min~ 40 min减幅渐弱，60 min和90min的浸膏得率变化不大。

2.2.4 离心转速对浸膏得率的影响 此单因素试验共考查了7个转速梯度，它们分别为：2000、4000、6000、10000、12000、14000、18000 r﹒min-1。所得实验结果如图4所示。

图 4 离心转速对浸膏得率的影响

由图4可知，随着离心转速的增加，浸膏得率呈逐渐减小的趋势，其中4000 r﹒min-1~6000 r﹒min-1、12000 r﹒min-1~18000 r﹒min-1间的浸膏得率变化幅度较大。

2.3 正交试验

在单因素试验的基础上，结合本试验实际，确定了4因素3水平的正交试验设计。以浸膏得率作为指标性成分，且浸膏得率越小越好。利用正交设计助手Ⅱ进行统计学分析，正交试验因素水平见表1；相应正交试验设计见表2；方差分析见表3。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验表

表 3 方差分析表

由表2、表3可知，4因素对提取工艺的作用强弱为：B＞A＞D＞C,直观分析得到的最佳纯化工艺为：A3B3C1D1，而比较D的均值可以发现：-5℃~10℃和11℃~20℃的均值差别不大。从减少能耗角度考虑，决定选择-5℃~10℃做为最佳离心温度，因此得到黄芪提取液的最佳纯化条件为：0.5 g﹒mL-1、离心转速18000 r﹒min-1、离心时间60 min、离心温度5℃~10℃。

2.4 验证性试验

根据最佳试验结果，本试验有作了3组平行试验来验证实验方案的重复性，结果表明重复性良好，所得数据如表4所示。

表 4 高速冷冻离心法的验证性试验

3 讨论

由验证性试验可知：纯化后的黄芪提取液浸膏得率缩小了9 % 左右，黄芪提取液的纯度由63.09 %上升到81.48 %，基本达到后续成型工艺的需要。

高速离心作为一种物理分离技术，其在分离过程中能有效防止中药有效成分的损失，最大限度地保留药物的活性成分，且还可以缩短工艺流程，降低成本，值得推广和使用，可为工业化大生产提供一定的借鉴和参考。

[1] 袁佳.丹参和红花提取液醇沉工艺及包裹损失现象的研究[D].浙江大学, 2011,10.

[2] 刘晓谦,仝燕,王锦玉,等.复方苦参注射液醇沉工艺优化及醇沉颗粒沉降过程研究[J].中国中药杂志,2011,36(22): 3108.

[3] 周晶,冯淑华.中药提取分离新技术[M].科学出版社,2011,249.