广州地区非综合征性耳聋患者耳聋相关基因突变分析

贾 蓓，李 琦，宋兰林，刘思平，钟 梅△

（南方医科大学南方医院：1.妇产科产前诊断与遗传病诊断技术中心；2.耳鼻喉科，广州 510515）

耳聋是严重影响人类健康和生活的疾病，在新生儿中的发生率达1‰～3‰［1］。2006年全国残疾人抽样调查结果显示我国现有听力残疾者在2 780万人，每年新生聋儿3万，居各类残疾之首［2］。耳聋可分为遗传性和非遗传性，60%以上的新生聋儿是由遗传因素导致的［3－4］。遗传性耳聋具有广泛的遗传异质性，根据是否伴有耳外组织的异常或病变可将其分为综合征性耳聋（syndromic hearing loss，SHL）和非综合征性耳聋（nonsyndromic hearing loss，NSHL）［5］。NSHL占70%以上，目前已定位了100多个NSHL相关位点，克隆了68个致病基因，包括40个常染色体隐性基因、25个常染色体显性基因、3个X连锁基因，每个基因中均散在多个耳聋突变位点。

不同种族不同地区的人群，耳聋基因突变热点有明显的差异。在欧美人群中，50%的NSHL由GJB2基因突变导致；其次是SLC26A4基因，5%～10%的NSHL与它有关；另外MYO15A、OTOF、CDH23和TMC1也是常见的耳聋致病基因［6］。而在中国人群中，聋病分子流行病学调查显示GJB2、SLC26A4、线粒体基因（A1555G和C1494T突变）是中国NSHL患者最常见的3个致病基因，且南北各地区间各基因检出率差异较大［7－8］。为了了解广州地区NSHL患者发病的分子机制，探讨耳聋临床表型与基因型之间的关系，本文应用遗传性耳聋基因芯片对广州地区的NSHL患者进行了常见耳聋相关基因的突变筛查。

1 资料与方法

1.1 一般资料 受检的耳聋患者均来自广州市及周边县市，共52例，全部为汉族，男32例，女20例，就诊年龄2～42岁，平均（18.2±3.5）岁。详细了解病史及耳聋相关信息，如耳聋发病年龄、诱因、用耳毒性药物史，头部外伤史、家族史等，进行全身、专科及影像学检查。结合病史排除其他症状和体征，52例患者均被诊断为NSHL。根据纯音测听结果，52例均为双侧感音神经性耳聋，46例重度以上耳聋（70dB以上），6例中度耳聋（41～70dB）。

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂及仪器 小量基因组DNA抽提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。晶芯九项遗传性耳聋基因检测试剂盒（微阵列芯片法），PCR仪（ABI 9700），芯片杂交仪（Bio MixerⅡ），芯片洗干仪（SlideWasher TM8），芯片扫描仪（Lux－Scan 10K－B）购自博奥生物技术有限公司。

1.2.2 DNA提取 患者或家属签署知情同意书后，采集受检者外周血2mL，用小量基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，并进行浓度及纯度检测，满足浓度100～200ng／μL，纯度OD260／280＝1.7～2.0。

1.2.3 耳聋基因芯片检测 应用遗传性耳聋基因芯片检测试剂盒对GJB2、SLC26A4、mtDNA12srRNA和GJB3四个耳聋相关基因的9个致聋突变位点进行检测。这9个位点为：GJB2基因的35delG，176del16，235delC，299delAT；SLC26A4基因的2168A＞G，IVS7－2A＞G；线粒体12SrRNA的1494C＞T，1555A＞G；GJB3基因的538C＞T。检测过程主要分3个步骤：多重不对称等位基因特异性PCR，扩增产物跟芯片杂交，芯片结果的扫描和判读。具体步骤参照试剂盒说明书。

1.2.4 统计学处理 收集资料后，数据分析采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

52例耳聋患者中，语前聋24例（其中先天性耳聋20例）；语后聋20例，平均发病年龄（4.02±1.35）岁；耳聋发病年龄不详者8例。聋前有明确耳毒性药物应用史者18例，其中语前聋8例，语后聋10例，用药年龄主要集中在婴幼儿期，用药原因多为感冒、发烧和腹泻，以应用氨基糖甙类及水杨酸类药物多见。有8名患者有明确的家族史，其中2名男性患儿是同胞兄弟为线粒体母系遗传，其余6名患者来自不同的家系均为隐性遗传。有5名患者颞骨CT显示前庭导水管扩张。

应用基因芯片方法在52例耳聋患者中共检出18例带有耳聋基因突变，检出阳性率为34.6%，见表1。其中，检出GJB2基因突变9例，包括235delC纯合突变6例，杂合突变2例，299delAT纯合突变1例；SLC26A4基因突变5例，IVS7－2A＞G纯合突变4例，杂合突变1例；线粒体12SrRNA A1555G均质突变4例。44名散发病例中检出13例（29.5%）携带突变，8名有家族史的患者检出5例携带突变（62.5%），见表2。

表1 广州地区52例NHSL患者耳聋基因突变检出结果

表2 18例携带耳聋基因突变患者基因型及表型的关系

24例学语前聋患者中检出11例带有耳聋基因突变（45.8%），20例学语后聋患者检出7例（35.0%），两组比较χ2＝0.530，P＝0.467（双侧），差异无统计学意义，认为学语前聋与学语后聋耳聋基因突变的检出率无差异。

18例带有耳聋基因突变的患者中，携带GJB2基因突变语前聋患者7例（77.8%），携带SLC26A4基因突变语前聋患者3例（60.0%），携带线粒体12SrRNA基因突变语前聋患者1例（25.0%），3组比较χ2＝3.293，P＝0.193（双侧），差异无统计学意义，认为3组中语前聋患者的比例无差异。

5名前庭导水管扩张患者均检出携带SLC26A4基因突变。4名线粒体12SrRNA A1555G均质突变患者均是应用氨基糖甙类药物后致聋。

3 讨 论

耳聋的相关基因众多，遗传异质性强，但大多数耳聋患者是由少数几个基因突变导致的，这为临床开展耳聋基因诊断及产前诊断提供了检测目标基因。郑文波等［9］、Dai等［10－12］、刘新等［13］在国内进行了大规模聋病分子流行病学研究，调查结果显示GJB2、SLC26A4、线粒体基因是中国人遗传性耳聋最常见的3个致病基因，21%的聋人带有GJB2基因突变、14.5%的聋人带有SLC26A4基因突变、3.4%和0.6%的聋人分别带有线粒体DNA A1555G和C1494T突变。在王国建等［14］的研究中，根据流行病学结果开发的芯片能检出42.41%NSHL患者。在本研究中，应用基因芯片方法对广州地区的NSHL患者的检出阳性率为34.6%，17.3%的耳聋患者携带GJB2基因突变，9.6%的患者携带SLC26A4基因突变，7.7%的患者携带线粒体12SrRNA A1555G突变；检出阳性率、GJB2基因及SLC26A4基因的携带率均低于全国平均水平，而线粒体基因突变的携带率明显高于全国平均水平。这些差异的原因可能是：（1）中国人基因在地域上存在差异性。中国地域广大，人口、民族众多，人种来源复杂，人群遗传背景在各地区存在差异。在Dai的研究中，研究对象65%以上为北方人群，南方人群仅局限在几个省市，在反映全国聋病分子流行病学趋势上倾向于北方人群。（2）基因芯片相对于传统酶切及测序等方法的检出率稍低（42.41%，44.30%），可能漏诊了基因其他位点突变的患者。（3）此次调查研究样本量不够大，存在抽样误差。

GJB2基因突变是导致NSHL最常见的原因，中国人群中学语前聋患者26%～33%由GJB2突变所致［9］，广州地区29.2%（7／24）的语前聋患儿由GJB2异常引起，最常见的致病位点是235delC，与国内外报道相同。本研究组中GJB2突变的NSHL患者，耳蜗神经和听觉中枢完整，如果接受人工耳蜗植入听力语言康复的效果将会较好，GJB2突变筛查是人工耳蜗植入术前一项重要的疗效预判检查［15］。

SLC26A4基因突变将导致大前庭导水管扩张综合征（enlarged vestibular aqueduct syndrome，EVAS）及Pendred综合征。我国约97%的EVAS患者能够检出SLC26A4基因突变，主要突变是IVS7－2A＞G。本研究中，5例前庭导水管扩张患者均检出携带SLC26A4基因突变，4例IVS7－2A＞G纯合突变，1例杂合突变。虽然有30%携带SLC26A4单条等位基因突变的患者会表现为前庭导水管扩张［11］，但杂合突变患者还应进一步检测SLC26A4基因其他位点，以明确基因型。前庭导水管扩张的患者，内耳环境脆弱，任何引起颅内压变化的因素如头部外伤、感冒发热等就能引起EVAS患儿听力下降。本研究中2例EVAS患者出生时听力正常，在感冒、头部震荡后出现听力下降，听力下降为波动性，总的趋势是越来越差。如果我们能在儿童早期进行SLC26A4基因筛查，不仅能明确病因，还可以提醒家长注意日常防护，保护残余听力，延缓患儿听力下降的速度。

线粒体mtDNA A1555G突变导致的耳聋主要与氨基糖甙类药物使用有关。突变携带者对氨基糖甙类药物很敏感，低剂量使用就会出现耳鸣，甚至致聋［16］。广州地区NSHL患者中的线粒体12SrRNA A1555G检出率（7.7%）明显超过全国平均水平（3.4%），表明在广州地区应该对线粒体mtDNA突变给予更多的重视。本研究中4例患者均是在应用氨基糖甙类药物后致聋，其中2例还是同胞兄弟，这提示在应用耳毒性药物治疗儿童疾病前，要注意了解患儿耳聋的家族史，有条件时应进行线粒体12SrRNA A1555G及C1494T位点筛查，避免一针致聋，全家多人因药致聋的惨剧发生。

通过分析广州地区NSHL患者相关耳聋基因突变，初步了解了广州地区耳聋患者发病的分子机制，在一定程度上丰富了中国人群耳聋基因突变频率和分布图谱。深入了解耳聋患者发病的遗传背景对在广州地区开展耳聋早期诊断、遗传咨询、及时干预和治疗至关重要。

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