丹酚酸A对牛血清白蛋白的荧光猝灭作用

张 曦, 寇 自 农, 石 羽 佳, 朱 靖 博,3

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034; 2.大连工业大学 分析测试中心, 辽宁 大连 116034; 3.大连工业大学 植物资源化学与应用研究所, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

蛋白质与其他物质发生相互作用时,蛋白质的荧光强度也会发生改变,这一变化是表征二者相互作用非常有效的方法。现有利用荧光光谱法研究小分子药物如秋水仙碱、Indo-1、芦丁等[1-3]与血清白蛋白相互作用的报道,然而未见文献报道研究丹酚酸A与血清白蛋白之间的相互作用。作为载体蛋白,其在血浆中含量丰富,能和许多内源小分子以及外源性物质广泛结合,在配体的传输和存储过程中起着十分重要的作用。因此研究丹酚酸A与血清白蛋白相互作用的信息对深入研究丹酚酸A的作用机制奠定了理论基础。

本实验在生理pH条件下研究丹酚酸A与牛血清白蛋白之间的相互作用,根据荧光猝灭光谱计算两者的结合常数和结合位点数,并判断它们之间的主要作用力类型。

1 材料与方法

1.1 试 剂

BSA用pH=7.4的Tris-HC1缓冲溶液配制成5×10-5mol/L的母液,4 ℃低温保存备用；丹酚酸A标准品,现用现配,工作液配制为梯度浓度；实验用水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

1.2 方 法

10 mL比色管中,依次加入0.5 mL 5×10-5mol/L 的BSA溶液和1.0 mL一定浓度的丹酚酸A溶液,超纯水定容至4 mL,混合均匀。在荧光光谱实验中,移取一定量该混合溶液于石英荧光池中。以280 nm为激发波长,设置激发狭缝宽度为7.0 nm,发射狭缝宽度为7.0 nm,扫描速率为600 nm/min,分别在25、30、35 ℃下测定288～488 nm的荧光发射光谱。

2 结果与讨论

2.1 丹酚酸A对BSA荧光光谱的影响

BSA分子包含色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸3种氨基酸残基,能够产生不同的荧光光谱,其荧光发射峰(λmax)分别位于348、303和282 nm。设定波长在280 nm时,BSA荧光发射峰位于340 nm附近。当BSA溶液浓度一定时,向其中加入不同浓度的丹酚酸A。结果如图1所示。

1～7,丹酚酸A浓度分别为2.27×10-6、4.53×10-6、9.06×10-6、1.36×10-5、1.81×10-5、2.27×10-5mol/L；BSA浓度为6.25×10-6mol/L

图1 不同浓度丹酚酸A与BSA作用的荧光发射光谱

Fig.1 The fluorescence emission spectrum of interaction between Sal A and BSA

随着丹酚酸A浓度的增加,BSA内源荧光强度规律性地降低,最大发射峰波长及峰形变化不大,这说明丹酚酸A对BSA有猝灭作用。

2.2 丹酚酸A对BSA的荧光猝灭机理

静态猝灭和动态猝灭是荧光淬灭的两种基本类型[4]。假设丹酚酸A对BSA的猝灭属于分子碰撞引起的动态猝灭,应符合Stern-Volmer方程[5]

F0/F=1+kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式(1)中,F0为未加猝灭剂时BSA的荧光强度；F为加入猝灭剂后BSA的荧光强度；[Q]为猝灭剂丹酚酸A的浓度；τ0为无猝灭剂时BSA作为荧光分子的平均寿命,对BSA来说,其τ0约为6.2 ns[6]；kq为荧光猝灭的速率常数；KSV为Stern-Volmer方程的猝灭常数,

ΚSV=kqτ0

(2)

若丹酚酸A对BSA的猝灭过程为静态猝灭,则应符合Lineweaver-Burk方程[5]

(3)

式(3)中,K为丹酚酸A与BSA的结合常数。不同温度下丹酚酸A对BSA荧光猝灭光谱,可由Stern-Volmer方程得到,结果如图2所示。由图2可看出,分别在25、30、35 ℃时F0/F-[Q]线性较差,温度对图线影响较小。根据不同温度下蛋白质荧光猝灭光谱,得到(F0-F)-1-[Q]-1的双倒数Lineweaver-Burk图,结果如图3所示。由图3则可看出,分别在25、30、35 ℃时(F0-F)-1-[Q]-1线性关系良好,不同温度下图线斜率变化显著。

图2 丹酚酸A对BSA的Stern-Volmer图

图3 丹酚酸A对BSA的Lineweaver-Burk图

由图2、3及公式(1)～(3)得出不同温度下丹酚酸A与BSA相互作用参数KSV、kq和K(见表1)。

表1 丹酚酸A与BSA不同温度下相互作用常数

Tab.1 Interaction constants of Sal A and BSA at different temperatures

θ/℃KSV/(L·mol-1)kq/(L·mol-1·s-1)K/(L·mol-1)r21r22251.78×1052.87×10141.49×1050.999 30.986 2301.86×1053.00×10141.19×1050.995 60.979 5351.63×1052.63×10148.24×1040.992 20.993 1注:r1、r2分别为Lineweaver-Burk和Stern-Volmer方程的相关系数。

由表1可以看出,提高环境温度并未表现出对Stern-Volmer直线斜率有所影响。而在动态猝灭过程中,各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数为2.0×1010L/(mol·s)[2]。显然,丹酚酸A对BSA的荧光猝灭速率远大于最大扩散碰撞猝灭速率常数。而提高环境温度使Lineweaver-Burk直线斜率增大,这是由于提高环境温度使丹酚酸A与BSA复合物的稳定性有所下降。由以上判断,丹酚酸A对BSA的相互作用由于形成了复合物而引起了BSA的内源荧光的荧光猝灭,属于静态猝灭范畴。

2.3 热力学性质

根据药物与蛋白质作用前后焓变ΔH和熵变ΔS判断二者间的主要作用力。由方程式(4)、(5)可分别计算出ΔH、ΔG和ΔS。在实验温度变化范围内,ΔH随温度的改变忽略不计。

ln(K2/K2)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

(4)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK

(5)

由公式(4)、(5)可求得丹酚酸A与BSA结合的热力学参数,结果见表2。

表2 丹酚酸A与BSA相互作用的热力学参数

Tab.2 Thermodynamic parameters of interaction of Sal A and BSA

T/KΔH/(kJ·mol-1)ΔS/(J·mol-1·K-1)ΔG/(kJ·mol-1)298-56.55-90.74-29.51303-56.55-89.47-29.44308-56.55-89.51-28.98

当ΔS>0,ΔH>0为典型的疏水作用力；ΔH<0,ΔS<0为氢键和范德华力；当ΔH<0,ΔS>0时,主要存在静电相互作用。由表2可见,ΔG<0,表明丹酚酸A与BSA的作用是一自发过程,ΔH<0,ΔS<0,表明丹酚酸A与BSA之间的作用力主要是氢键和范德华作用力。

2.4 丹酚酸A与BSA的结合位点数

由于丹酚酸A与BSA之间属于生成复合物的静态猝灭,假设BSA有n个相同且独立的结合位点可与丹酚酸A结合。如nQ+M→QnM。式中M为BSA分子；Q为丹酚酸A分子；QnM为复合物,生成常数为K。若BSA总浓度[M0]=[QnM]+[M]([M]为游离BSA浓度), 则有[QnM]=[M0]-[M]。

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]

(6)

通过其斜率和截距计算得丹酚酸A与BSA的结合位点数n为1.158。

3 结 论

丹酚酸A与BSA的相互作用使BSA内源荧光规律性猝灭,猝灭机理为静态猝灭,形成了复合物,结合常数较大,丹酚酸A与BSA之间主要由氢键和范德华作用力维系。25、30、35 ℃时丹酚酸A与BSA反应的结合常数分别为1.49×105、1.19×105、8.24×104L/mol,焓变ΔH=-56.55 kJ/mol。结合位点数为1.158,说明BSA可以携带丹酚酸A在体内进行运输、代谢和分配。对丹酚酸A与BSA相互作用以其他监测手段的新方法有待于进一步深入研究。

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