槲皮素作为饲料添加剂的急性毒性和致突变性评价

冯香安 李 垚 刘 莹 金 芳 张 琳 呼林林 索艳丽

(东北农业大学动物营养研究所，哈尔滨 150030)

槲皮素是一种广泛存在于自然界水果、蔬菜和谷物中的植源性黄酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌消炎、保护肝肾和心血管及止腹泻等作用[1]。在畜牧生产中，槲皮素可保护胚胎的鸡精原细胞免于三乙基四硝基酚的氧化损伤，进而防止环境污染物对鸡繁殖性能的损害[2]。此外，槲皮素对禽流感感染有一定的防治作用[3]，还可以显著提高鸡成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性和细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化水平[4]，减少肉鸡脂肪沉积[5]等。从以上功能来看，槲皮素可以作为一种饲料添加剂应用于动物生产，对我国畜牧业可持续发展具有一定意义。然而，槲皮素作为饲料添加剂的安全性一直未得到证实，本试验拟通过急性毒性试验、污染物致突变性检测(Ames试验)、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验对槲皮素作为饲料添加剂的安全性作出评价。

1 材料与方法

1.1 受试物

槲皮素(C15H10O7·2H2O，纯度为97%，阿拉丁公司)。

1.2 试验动物

清洁级昆明种小鼠，由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供[许可证号:SCXK-(吉)2007-0003]。

1.3 菌株

Ames试验采用鼠伤寒沙门菌突变型菌株TA97、TA98、TA100和 TA102，由黑龙江省疾病预防控制中心提供;肝微粒体多氯联苯诱导剂(S9)由黑龙江省疾病预防控制中心提供。

1.4 试验方法[6-7]

1.4.1 急性毒性试验

采用限量法进行试验，选用健康清洁级昆明种小鼠20只，体重18～20 g，雌雄各占1/2。试验前隔夜禁食16 h，不禁水。取槲皮素5 g加0.5%羧甲基纤维素至20 mL混匀，按照20 mL/kg BW给予受试物混合物，间隔4 h 2次经口灌胃，第2次灌胃后2 h复食。染毒剂量为10 g/kg BW，给药后连续观察14 d，记录中毒表现和死亡情况。

1.4.2 Ames试验

选用鼠伤寒沙门菌突变型菌株TA97、TA98、TA100和TA102作为测试菌株，设5个槲皮素剂量组以及阴性对照组和阳性对照组，槲皮素试验剂量分别为 5 000、1 000、200、40、8 μg/皿。由于本试验溶剂采用蒸馏水，所以不重复增设溶剂对照组，阴性对照组中蒸馏水剂量为0.1 mL/皿;阳性对照组试剂采用敌克松、叠氮钠、2-乙酰氨基芴和1，8-二羟蒽醌，剂量分别为50.0、1.5、10.0和50.0 μg/皿，在加与不加S9混合液的情况下采用平板掺入法进行试验，每个剂量重复3皿，每个试验重复2次。记录每皿回复突变菌落数。

1.4.3 小鼠骨髓细胞微核试验

选用体重为25～30 g清洁级昆明种小鼠50只，雌雄各占1/2，随机分为5组。设3个槲皮素剂量组，试验剂量分别为5.0(高剂量组)、1.0(中剂量组)和0.2(低剂量组)g/kg BW，阴性对照组为0.5%羧甲基纤维素，阳性对照组为环磷酰胺，浓度为40 mg/kg BW，采用腹腔注射法。各组均按30 h给受试物法给药。2次给受试物间隔24 h，第2次给受试物后6 h处死动物。取胸骨常规制片、镜检。每鼠计数1 000个骨髓嗜多染红细胞(PCE)，并计算微核发生率，以千分率表示。每鼠计数200个 PCE，并计算 PCE与成熟红细胞(RBC)比值(PCE/RBC)。

1.4.4 小鼠精子畸形试验

选用体重25～35g雄性清洁级昆明种小鼠50只，随机分为5组。设3个槲皮素剂量组，试验剂量分别为5.0(高剂量组)、1.0(中剂量组)和0.2(低剂量组)g/kg BW，阴性对照组为0.5%羧甲基纤维素，阳性对照组为环磷酰胺，浓度为40 mg/kg BW。各组每日灌胃1次，连续5 d，在首次给予受试物35 d后处死，按常规方法制片，甲醇固定5 min，用2%苏木精-伊红(HE)溶液染色1 h，每只动物在显微镜下镜检1 000个完整精子，计算精子畸形率。

1.5 数据处理

采用SPSS 17.0进行统计分析，结果用平均值±标准差表示。急性毒性试验结果采用单因素方差分析(one-way ANOVA);Ames试验结果和小鼠骨髓细胞微核试验结果均采用卡方检验方法分析;小鼠精子畸形试验结果采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 急性毒性试验

由表1可见，经过14 d观察，本次试验的20只小鼠在给药后全部表现正常，饮水、采食及大小便均无较大变化，无一死亡;试验结束时增重差异均不显著(P＞0.05)。在试验第14天将全部小鼠脱颈处死，剖检，肉眼观察其内脏。心、肝、脾、肺、胃、肾、胸腺均未见任何异常变化。结果表明，槲皮素的半数致死剂量(LD50)＞10 g/kg BW，属于实际无毒类物质。

表1 急性毒性试验Table1 Acute toxicity test

2.2 Ames试验

由表2、表3、表4、表5可见，槲皮素各剂量组对Ames试验各菌株在加与不加S9情况下，经过2次试验的回复突变菌落数均在正常范围内，并且没有剂量反应关系;各剂量组与阴性对照组的回复突变菌落数比较差异不显著(P＞0.05)，与阳性对照组的回复突变菌落数比较差异极显著(P＜0.01)，Ames试验结果均呈阴性，即鼠伤寒沙门氏菌试验为致突变阴性结果。

表2 槲皮素第1次Ames试验(-S9)Table2 The first Ames test for quercetin(-S9)

表3 槲皮素第1次Ames试验(+S9)Table3 The first Ames test for quercetin(+S9)

表4 槲皮素第2次Ames试验(-S9)Table4 The second Ames test for quercetin(-S9)

表5 槲皮素第2次Ames试验(+S9)Table5 The second Ames test for quercetin(+S9)

2.3 小鼠骨髓细胞微核试验

由表6可见，雌、雄小鼠的PCE/RBC、微核数和微核率高、中、低剂量组与阴性对照组相比差异均不显著(P＞0.05)，并且无剂量反应关系;阳性对照组与其余各组相比差异极显著(P＜0.01)，说明槲皮素的小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性。此外，各剂量组的PCE/RBC差异均不显著(P＞0.05)，说明各剂量组动物未见细胞毒性作用。

表6 小鼠骨髓细胞微核试验Table6 Micronucleus test of mouse bone marrow cells

2.4 小鼠精子畸形试验

由表7可见，各组小鼠均有一定数量的畸形精子出现，高、中、低剂量组与阴性对照组相比差异均不显著(P＞0.05)，且没有剂量反应关系;高、中、低剂量组及阴性对照组与阳性对照组比较差异极显著(P＜0.01)。结果表明，槲皮素对小鼠精子畸形发生率没有影响，即槲皮素对小鼠精子畸形试验的结果为阴性。

表7 小鼠精子畸形试验Table7 Mouse sperm abnormality test

3 讨论

急性毒性试验是为了了解受试物的毒性强度和性质，槲皮素对小鼠的LD50＞10 g/kg BW，小鼠未出现中毒表现、死亡和其他迹象。按照安全评价程序[6-7]，当 LD50＞10 g/kg BW 时属实际无毒物质，可不必求得确切的LD50值。在20世纪50年代有国外学者采用家兔来评价槲皮素的急性毒性，其结果也表明槲皮素为无毒物质[8]。

Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验及小鼠精子畸形试验均属于致突变试验，其目的是对槲皮素是否具有致突变作用的可能性进行筛选。Ames试验是通过鼠伤寒沙门氏菌来检测受试物是否具有诱变性的一种体外试验方法;小鼠骨髓细胞微核试验主要是对染色体结构完整性的改变进行评估;小鼠精子畸形试验是基于已知的生殖细胞对致突变物具有高度的敏感性，是检测受试物对生殖细胞致突变作用的一种标准的体内试验方法。在本试验中，槲皮素的Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验及小鼠精子畸形试验结果均呈阴性，表明槲皮素不具有致突变作用。国内外对植物黄酮类物质的安全评价研究很多，本试验与大多数植物黄酮类化合物的安全性评价结果一致[9]，如大豆异黄酮[10]、麻竹叶黄酮[11]、葡萄多酚[12]、苹果多酚[13]、蛇麻素[14]等植物黄酮类物质的致突变试验结果均为阴性。而国外有研究表明，槲皮素具有致突变性，这与本试验结果不符，但是对这一结果的安全评估系统尚未建立，所以这一结果是不确切的[15];又有 Helena 等[16]、Silva 等[17]、Utesch等[18]对槲皮素的致突变性做过研究，其结果均为阴性，与本试验相一致。

由于槲皮素潜在的抗氧化功能和其他有益于健康的功能，其在各种食品中的应用一直有增无减。但是，槲皮素在毒性方面又被证实了体外阳性诱变结果[19]。然而，很多动物试验一直未能证明槲皮素的摄入与肿瘤患病率增加有任何关系。一些研究指出，槲皮素虽然在体外显示有诱变活性，但是在体内并没有显现致癌效果[1，20-23]。Okamoto[24]在研究中指出口服槲皮素是不会产生任何不利影响的。所以，结合本试验结果，在适当剂量下口服槲皮素不会对动物产生毒性作用。

总之，本试验采用急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验及小鼠精子畸形试验4种方法，兼顾了体内与体外、体细胞和生殖细胞以及真核细胞和原核细胞的原则，较全面地评价了槲皮素的安全性，表明槲皮素是一种安全的饲料添加剂，可以广泛地应用于畜牧生产中。

4 结论

①槲皮素的LD50＞10 g/kg BW，属于实际无毒类物质。

②槲皮素对鼠伤寒沙门氏菌各菌株无致突变性。

③槲皮素对小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性，且未见细胞毒性。

④槲皮素对小鼠精子畸形发生率没有影响。

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