‘金薄香’核桃新品种同工酶分析初报

王勇，张海涛，杨晓宇，赵士粤，温映红，武彦霞，刘朝红，田鑫

（山西省农业科学院 果树研究所，山西 太谷030815）

‘金薄香’核桃是山西省农科院果树研究所以新疆优质薄皮核桃为母本采用实生选种法经过20多年选育而成的1～8号系列早实薄壳优良新品种。近年来研究［1，2］表明，植物的表型特性遗传是数量性状遗传，有分离现象，是由多基因控制的性状。植物的一些优良表型性状，通过同工酶分析，可作为品种鉴定、苗木繁殖、遗传多态性分析的依据。为深入了解‘金薄香’核桃新品种的遗传特性，本试验以‘金薄香’8个核桃新品种为试材，对其品种间同工酶酶谱的差异进行研究，以期探究核桃性状的遗传规律。利用同工酶作为遗传信息表达的指标，从遗传角度探讨各品种分类性状的价值及品种间的亲缘关系，并为寻找早实核桃基因表达及分子标记等一系列研究提供基础［3～5］。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所选用材料为山西省农科院果树所试验园的‘金薄香’核桃母株。采样时期及部位：于2010年7月15日取自上而下第三功能叶片。

1.2 方法

试材叶片，采后立即放于编号的密封袋内，投入冰盒内并带回实验室。用蒸馏水将叶片冲洗干净，用滤纸吸干表面水分并用电子天平称取1.0g，剪碎后放入研钵进行液氮研磨，转入10mL离心管内，再加入6mL样品提取液，低温静置后置于高速冷冻离心机，温度调至0～4℃，转速12 000 r·min－1，离心20min，取上清液电泳。

采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳，依次在样品槽内加样后在电泳槽内缓慢加入电极缓冲液，滴加溴酚蓝指示剂，接通电源开始电泳，预电压为稳压120V，当溴酚蓝指示剂进入分离胶后将电压调至稳压240V，电泳槽置于4℃冰箱内进行电泳。当溴酚蓝指示剂距分离胶底面1～2cm时结束电泳后，进行POD，SOD，AMY，PPO四种同工酶的染色。

过氧化物酶POD染色［6］：取醋酸联苯胺溶液（2g联苯胺溶于18mL冰醋酸，加水72mL）1 mL，3%过氧化氢0.4mL，加水至20mL（临用现配），将胶板置于上述染色液中，在37℃下保温10min。

淀粉酶AMY染色［6］（负染）：胶板在1%淀粉溶液（用0.04mol·L－1pH 7.0 的磷酸缓冲液配制）中于25℃保温30min，用0.04mol·L－1pH 7.0磷酸缓冲液洗涤10min ，再浸入0.005 mol·L－1I2－KI试剂中，轻微振荡数分钟。

以上染色后的胶板用双蒸水冲洗，置于5%醋酸中保存，拍照或描模式图谱。

超氧化物歧化酶（SOD）染色方法：将胶板冲洗1～2次，置于含0.25mol·L－1NBT的0.05mol·L－1，pH 7.8磷酸盐缓冲液内黑暗振荡染色20 min，弃去染液；再将胶板置于含0.01%核黄素的0.05mol·L－1，pH 7.8磷酸盐缓冲液内黑暗振荡染色20min，弃去染液；最后将其置于含0.1mmol·L－1EDTA的0.05mol·L－1，pH 7.8磷酸盐缓冲液中，在距胶板10cm处40W日光灯光照15～20min即可看到浅紫色背景下的白色条带。蒸馏水漂洗1～2次后拍照记录。

多酚氧化酶（PPO）酶染色方法：将胶板置于50mL 0.01%对苯二胺，150mL 1%邻苯二酚，50 mL 0.05mol·L－1，pH 6.8磷酸盐缓冲液的混合染色液中，于30℃恒温振荡染色30min，弃掉染色液，加入脱色液振荡脱色至红褐色条带清晰为止。

相对迁移率Rf的计算公式如下：

酶带迁移率 ＝ 酶带迁移距离／溴酚蓝指示剂迁移距离。

2 结果与分析

2.1 淀粉酶AMY同工酶酶带分析

如图1所示，自右到左分别为‘金薄香’1号到8号。如图谱所示，统计每个品种各自的酶带数，8个品种都有3条基本的共有谱带，其表达量较高。6号、7号除基本共有谱带外，还有一条特异性酶带。除6号外，其他7个品种还有一条基本的共有酶带，表达量较弱。根据淀粉酶酶带A2可区别6号、7号与其他品种。采用AMY同工酶分析法可以对‘金薄香’品种间进行辅助鉴定。

图1 AMY同工酶酶带分析图Fig.1 Amylase isoenzymes bands of Jinboxiang Series Walnut

2.2 多酚氧化酶PPO同工酶酶带分析

如图2所示，自右到左分别为金薄香1号到8号。由图2可看出，PPO酶带较少，统计每个品种各自的酶带数 ，计算其各自酶带的相对迁移率，8个品种都有3条基本的共有谱带，迁移率分别为0.47，0.50和0.53，表达量较高，并无特异性差异酶带。1号、3号、4号多酚氧化酶表达量最高，2号、7号表达量中等，5号、6号表达量最低。根据多酚氧化酶酶带不能鉴别金薄香系列核桃品种。采用PPO同工酶分析法不能对‘金薄香’品种间进行辅助鉴定，不作为较为方便和有效的手段。

图2 PPO同工酶酶带分析图Fig.2 Polyphenol oxidase isoenzymes bands of Jinboxiang Series Walnut

2.3 超氧化物歧化酶SOD同工酶酶带分析

如图3所示，自右到左分别为金薄香1号到8号。根据酶谱电泳分离特性划分区带，按照从阴极到阳极的顺序，可将“金薄香”系列核桃的SOD同工酶谱带大致分为2个区，分别是SODA区和SODB区。按照从阴极到阳极的方向依照所属区间再用数字编号，统计每个品种各自的酶带数，计算出各自酶带的相对迁移率，由图3可看出，2号、4号、5号、7号和8号第一区（SODA区）的共同酶带位置有3个，电泳迁移率分别指示为0.19，0.24和0.27。3号、6号品种都无此酶带。第二区（SODB区）中8个品种都有8条基本的共有谱带，其迁 移 率分别为 0.46，0.48，0.51，0.54，0.58，0.62，0.66，0.79。从电泳图谱和酶带数统计来看，2号、5号、7号和8号的电泳图谱完全相同外，其他每一个品种的SOD同工酶图谱都具有特异性，相互之间区别明显。1号有一条特异性酶带S4，迁移率为0.42。3号、4号、7号缺少迁移率为0.42的酶带S5。因此，采用SOD同工酶分析法可以对‘金薄香’品种间进行辅助鉴定。

图3 SOD同工酶酶带分析图Fig.3 Superoxide dismutase isoenzymes bands of＇Jinboxiang＇Series Walnut

2.4 过氧化物POD同工酶酶带分析

如图4所示，自右到左分别为金薄香1号到8号。过氧化物酶酶带较少，统计每个品种各自的酶带数，计算出各自酶带的相对迁移率，8个品种都有4条基本的共有谱带P1，P2，P3，P4，迁移率分别为0.36，0.37，0.41，0.44。Rf＝0.47酶谱带P5为8号的特有带，Rf＝0.55，Rf＝0.59两条酶带P6和P7是1号、3号、4号的共有酶带。根据过氧化物酶特异性酶带P5可鉴定8号，酶带P6和P7可区别1号、2号、3号、4号与其他品种。采用POD同工酶分析法对‘金薄香’品种间进行辅助鉴定是一种较为方便和有效的手段。

图4 POD同工酶酶带分析图Fig.4 Peroxidase isoenzymes bands of＇Jinboxiang＇Series Walnut

3 小结与讨论

同工酶是一种特异蛋白质，是基因（DNA片段）表达的直接产物，不同基因组成会在同工酶谱上表现出来，即同工酶是基因分子水平的表现型，是基因和外在性状的连接物，基因的微小变化会引起同工酶的变化。因此，可从同工酶谱的变化及酶谱特征了解品种间的亲缘关系和品种间的差别。植物在进化过程中，形成了不同亲缘关系的物种，一定的亲缘关系反映了植物在基因型上存在某种相关性，分类学中一般依据物种所表现的性状来判断这种联系。同工酶是基因表达的产物，可以从同工酶酶谱的分析来识别基因的存在和表达，种与种或品种之间，酶谱的共同特征越多，说明亲缘关系越近。

聚丙烯酰胺凝胶电泳的垂直板型电泳法是近年来用途较广的一种相对含量的测定方法。它的优点是在同一条件下可以电泳多个样品，便于相互比较；另外还可以制成干板便于扫描、携带和保存。

采用AMY、SOD、POD同工酶3种分析法，‘金薄香’核桃品种间同工酶带差异较明显，可以作为对‘金薄香’品种进行辅助鉴定的有效方法。而采用PPO同工酶分析法，同工酶带差异不显著，不能作为对此品种进行辅助鉴定的方法。

［1］Praka S R C Lewotlin.J L Hubby.A Molecular approach tot the study of genetic heterozygosity in natural population，patterns of genetic variation in cetrol，marginal and isolated populations of drosophila pseudoobscura［J］.Genetics，1969，61：841－858.

［2］张以忠，陈庆富.同工酶在植物系统学研究中的作用［J］.贵州师范大学学报：自然科学版，2005，23（2）：107－112.

［3］胡能书，万贤国.同工酶技术及其应用［M］.长沙：湖南科学技术出版社，1985：104－112.

［4］王金胜.农业生物化学技术［M］.太原：山西科学技术出版社，1997：64－80.

［5］毛盛贤，向华.同工酶遗传学引论［M］.北京：首都师范大学出版社，2000.

［6］何忠效，张树政.电泳［M］.北京：科学出版社，1999：258－308.