线粒体ND4基因12026A→G变异与2型糖尿病的相关性研究

郑寿焕 杨秀丽 李兰 车惠英 王敬衔 姚庆春

糖尿病是最常见的内分泌代谢性疾病，是一种多基因疾病，遗传因素在糖尿病的发生发展中起着重要的作用，近年来学者们应用分子生物学技术，研究糖尿病的候选基因，探讨其遗传学发病机制。文献报道，在不同种族、不同地区的2型糖尿病患者中线粒体基因的突变率不同，线粒体基因突变与糖尿病关系的观点不一［1，2］。本研究对延边地区328例2型糖尿病患者(其中80例有家族史)及108例正常对照组线粒体DNA ND4基因进行突变分析，旨在探讨延边地区T2DM患者线粒体DNA基因变异情况及线粒体基因变异与2型糖尿病的相关性。

1资料与方法

1.1 研究对象 随机选取在延边大学附属医院健康体检者108例:男65例、女43例，平均年龄(30.4±9.7岁)作为正常对照组，临床和实验室检查均正常，排除肝、肾、内分泌和心脑血管疾病，近3个月无服用任何药物史;选取2009年12月至2012年2月在延边大学附属医院内分泌科住院的2型糖尿病患者328例:男194例、女134例，平均年龄(35.1±6.9)岁。糖尿病诊断依据1999年WHO诊断标准，排除妊娠、急性感染、肿瘤、外伤、心、肝疾病及服用羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂、噻唑烷二酮类药物者。根据线粒体DNA基因变异情况将T2DM患者分为基因变异组和基因非变异组。所有受检对象均为延边地区无血缘关系个体，均签署知情同意书。

1.2 研究方法 ①基因组DNA提取:采用Promega公司生产的Wizard@Genomic DNA Purification Kit提取DNA。取被受检者肘静脉血2 ml到加有EDTA抗凝剂的真空采血管中，并立刻颠倒混匀，置于离心机中3000转离心10 min，取300 μl白细胞加入到1．5 m l离心管中，按照细胞裂解、核裂解、RNA去除、沉淀蛋白质、析出DNA、清洗DNA、水化DNA的过程分别加入试剂，进行DNA的提取。所得DNA经紫外分光光度计定量，并置于-70℃保存备用。②PCR扩增 m tDNA ND4区域基因片段，根据GenBank中所报告的序列参考文献报道［3］，采用北京华美公司合成的上游引物上游引物:5′-TTT ACCACAACACAATGGGG-3′，下 游 引 物 5′-AAGGGGTCGTAAGCCTCTGT-3′;PCR 扩增体系(50 μl):包括 5×Green GO Taq Buffer 10 μl，MgcL22 μl，dNTP 1 μl，上游 1 μl，下游1 μl，Taq DNA 聚合酶，0．25 μl，灭菌注射用水29．75 μl，DNA 5 μl;PCR循环参数:95℃预变性5 min，95℃变性 30S，60℃退火30S，72℃延伸30S，循环35次，最后72℃延伸10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。③PCR产物的限制性酶切:20μl酶切体系包括PCR产物5μl，HincII内切酶 0．5 μl，灭菌注射用水14．5 μl，置于 37℃水浴箱中水浴 3 h。5%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。④PCR扩增产物直接测序:PCR产物用凝胶电泳DNA回收试剂盒纯化回收DNA片段后，送北京奥莱博生物技术有限责任公司，完成PCR扩增产物测序。

1.3 统计学方法 用SPSS 17．0软件包进行分析。主要检测指标均进行资料分布类型检验和方差齐性检验，正态分布的各统计指标以均数±标准差(±s)表示，行t检验，率的比较行χ2检验。

2 结果

2.1 线粒体DNA ND4(nt11990-12199)区域经PCR扩增后得到产物片段长度为209bp(见图1)，限制性内切酶HincⅡ酶切识别位点为GTY↓RAC(R=A或G，Y=G或T)，线粒体DNA 12026位点发生变异时将被分割成171bp和38bp两个片段。(见图2)。直接测序发现线粒体基因12026位点发生A→G变异(见图3)。

2.2 在328例2型糖尿病患者中共检出线粒体DNA 12026 A→G变异20例，其变异率为6．1%;在108例对照组中检出线粒体DNA 12026 A→G变异1例，其变异率为0．9%(χ2=4．740，P ＜0．05)(见表1)。

2.3 2型糖尿病患者中线粒体基因12026A→G变异组与非变异组在空腹血糖，糖化血红蛋白及肌酐比较有统计学差异，P＜0．05;在病程，体重指数，餐后2 h血糖等临床资料比较无统计学差异，P ＞0．05(见表2)。

图1 线粒体基因ND4(12026)2%琼脂糖凝胶泳结果

图2 HincⅡ酶切线粒体基因ND4(12026)5%琼脂糖凝胶电泳结果

图3 线粒体基因ND4 12026(A→G)变异反向测序图

表1 线粒体ND4基因12026在病例组与对照组中的变异情况(例，%)

表2 2型糖尿病患者线粒体基因12026A→G变异及非变异的临床生化指标(±s)

表2 2型糖尿病患者线粒体基因12026A→G变异及非变异的临床生化指标(±s)

组别 例数(n)病程(years)BMI(kg/m2)FBG(mmol/L)PBG(mmol/L)HbA1c(%)Cr(μmol/L)9 8．38 ±0．74 92．75 ±8．81非变异 308 8．83 ±5．78 23．84 ±2．40 5．92 ±1．68 10．59 ±1．95 7．36 ±0．49 74．42 ±14．94 P 值 0．75 0．64 0．02﹡ 0．11 0．001﹡ 0．02变异 20 8．08 ±5．48 24．36 ±2．87 7．93 ±2．24 12．28 ±2．9﹡

3 讨论

线粒体是真核生物中的细胞器，是细胞的供能场所，它主要通过氧化磷酸化为生物组织和细胞提供进行生命活动所需的的能量和ATP。mtDNA是独立于细胞和染色体以外的由16569个碱基对组成的环状双链DNA分子，具有自我复制、转录和翻译功能。每个卵细胞含有几十万个线粒体DNA，而精子的线粒体集中于尾部，受精时，仅精子头部与卵子细胞融合成成合子，受精卵中的线粒体遗传物质均来自于母系，因此mtDNA的遗传是母系遗传而不是孟德尔遗传特点［4］。

线粒体DNA 12026A→G的突变使得由其编码的异亮氨酸被缬氨酸取代，该变异改变了NADH脱氢酶(复合体工)亚单位4的二级结构，从而影响呼吸链复合体Ⅰ-Ⅳ酶活性，影响线粒体氧化磷酸化的能力，ATP生成减少，降低胰岛细胞分泌胰岛素的能力，使胰岛素作用缺陷，从而诱发糖尿病［5］。

文献报道，日本2型糖尿病患者中发现该位点变异，变异率为3.95%，正常人群中该位点的变异率为0.87%，两者之间差异有统计学意义［6］。国内研究认为该位点变异只是人群中的一种基因多态性并且该位点的变异与自身免疫功能有关［7，8］。本次实验中在328例2型糖尿病患者中共检出线粒体DNA 12026 A→G变异20例(其中16例变异个体合并糖尿病肾损伤)，其变异率为6.1%;在108例对照组中检出线粒体DNA 12026 A→G变异1例，其变异率为0.9%(χ2=4.74，P＜0.05)，研究结果提示，线粒体DNA 12026 A→G变异与延边地区2型糖尿病的发生有一定的相关性。

综上所述我们认为线粒体DNA 12026 A→G变异与延边地区2型糖尿病的发生有一定的相关性，可能加重糖尿病的病情;线粒体DNA 12026 A→G变异与FBG，HbA1c和Cr有关。但线粒体DNA 12026 A→G变异与糖尿病肾损伤的具体关系及影响机制仍需进一步的研究。

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［5］ Liu SM，et al.Novelmutations found in mitochondrial diabetes in Chinese Han population.Diabetes Res Clin Pract，2007，76(3):425-435．

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