利用异化金属还原菌和锰尾矿处理制药废水

冯雅丽，张茜, ，李浩然，王李娟, ，毕耜超,

(1. 北京科技大学 土木与环境工程学院，北京，100083；

2. 中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室，北京，100190)

异化金属还原(Dissimilatory metal reduction)是指微生物利用金属氧化物作为呼吸作用最终电子受体的还原过程[1−2]，异化金属还原菌种主要来自深海沉积物[3]和土壤[4]等，主要应用于微生物燃料电池[5]、生物浸矿[6−7]等方面。利用异化金属还原菌进行生物修复[8]已开始引起关注，相关研究集中在重金属的治理和有机污染物的降解两个方面[9]，在废水处理方面的研究相对较少，主要集中于对单一有机物的降解，如芳香化合物[10]和偶氮染料[11]等，在制药废水处理方面未见报道。本文作者从厌氧活性污泥中分离出异化金属还原菌菌种，并对其进行驯化，利用实际制药废水作为底物，以锰尾矿作为氧化剂，考察不同矿用量、反应pH、反应温度等条件对废水处理效果的影响。利用微生物异化还原作用处理制药废水是一种环境友好、以废治废的方法，为废水处理提供了新的途径。

1 实验

1.1 实验材料

培养基成分[12]如下：KCl 0.1 g/L，NH4Cl 0.2 g/L，NaH2PO40.6 g/L，NaHCO32.5 g/L，Wolfe 微量维生素混合液、微量矿物元素混合液(参照美国菌种库ATCC的第1768号培养溶液)各10 mL/L，电子供体醋酸钠10 mmol/L，电子受体Fe(OH)3或锰尾矿按化学计量比例加入。Fe(OH)3由FeCl3和NaOH反应制取，经洗涤后于厌氧培养箱自然干燥保存。

1.2 实验方法

菌种培养方法：将配好的培养基调pH为6.8～7.2，分装入厌氧培养管中密封，于高压灭菌锅于121 ℃灭菌15 min。在厌氧培养箱中进行接种等操作，于30 ℃静置避光厌氧培养。

废水处理实验：在250 mL的锥形瓶中加入一定量废水、锰矿和菌液，通氮气10 min以去除溶液中的氧气，密封置于恒温水浴摇床中，控制反应温度和振荡速度，反应一定时间，定期取样检测。

1.3 分析方法

铁离子的测定采用邻菲罗啉分光光度法；锰离子的测定采用高碘酸钾氧化光度法；pH采用pHS−25型pH计测定；COD采用重铬酸钾滴定法测定。

2 结果与讨论

2.1 菌种的分离和驯化

对厌氧活性污泥中的菌种进行筛选分离，利用NaAc作为电子供体，Fe(OH)3为电子受体[13]，接种活性污泥量为10%，Fe(III)被还原的反应见式(1)。经过8 d的厌氧培养，厌氧管中的砖红色Fe(OH)3沉淀变成黑色颗粒，此黑色颗粒具有明显的顺磁性，培养过程中溶液Fe2+浓度随时间变化关系见图1。

由图1可知：反应初期培养基中Fe2+含量随时间延长迅速增加，表明异化金属还原菌已经开始把Fe3+还原为Fe2+，而Fe2+浓度在3～4 d时达到峰值又逐渐下降，这是因为溶液中Fe2+沉积在Fe(OH)3颗粒表面并与其结合，厌氧管中的黑色颗粒就是反应后形成磁铁矿(Fe3O4)。

菌液的吸光度反映了菌液的浑浊程度，因此可以表征菌种的生长情况[14]，测定波长为600 nm，吸光度与时间的关系见图2。由图2可知：随着培养时间的增长，菌液浓度逐渐增加，经过8 d的培养，菌液变得浑浊，说明菌体数目逐渐增多，认为已从活性污泥中分离筛选出异化金属还原菌，将悬浊液于700 r/min离心10 min，取上清液作为接种液。

图1 菌种培养阶段菌液中Fe2+浓度的变化Fig. 1 Concentration changes of Fe2+ in microbic liquid during culturing

图2 菌种培养阶段中菌液吸光度的变化Fig. 2 Changes of absorbance of microbic liquid during culturing

菌种于培养基中连续培养3代，将富集的菌液接种到以锰尾矿作为电子受体的培养基中，进行菌种的耐矿性驯化试验。以 NaAc作为有机底物时，MnO2作为电子受体，异化金属还原菌还原锰尾矿的过程可用反应式(2)表示，驯化过程中Mn2+浓度如图3所示。

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由图3可见：经过10 d的驯化，Mn2+总浓度逐渐上升，尾矿中的 Mn4+被还原为 Mn2+，表明异化还原菌已逐渐适应锰尾矿。取驯化后的悬浊液于700 r/min离心 10 min，得到的上清液作为之后实验的接种液保存。

图3 菌种驯化阶段菌液中Mn2+浓度与时间的关系Fig.3 Relationship between concentration of Mn2+ and time during domestication

2.2 锰尾矿用量的影响

菌种已经可以适应尾矿，将其应用于实际废水的处理，以废水中有机物作为电子供体，以 COD浓度表征有机物含量。实验条件为：反应温度30 ℃，振荡速度170 r/min，接种量10%，pH=7.0，尾矿加入量分别为0.5，1.0，2.0和5.0 g/L，反应过程中不同投矿量条件下废水COD与时间的关系见图4。

图4 不同尾矿用量下废水COD浓度与时间的关系Fig.4 Relationship between COD concentration and time at different tailings dosages

由图4可知：对于不同尾矿用量的废水处理，随着时间的延长COD均呈下降趋势，开始时COD下降迅速，因为尾矿粒径小，具有一定的吸附作用，而吸附发生的速度快，在 20 h左右吸附达到饱和，之后COD逐渐下降主要是微生物的异化还原作用。当锰尾矿用量为0.5 g/L时，处理效果明显低于其他用量，因为MnO2作为反应物直接参与氧化还原反应，当其用量不足时，由于缺少电子受体，氧化还原反应不能继续进行，造成处理效果较差。锰尾矿用量为2.0 g/L和5.0 g/L时，在反应的20 d时间内，COD始终呈下降趋势，说明Mn4+含量足够维持反应进行，随着氧化还原反应的进行，有机物被微生物同化，因此 COD逐渐降低。然而锰尾矿投加量2.0 g/L和5.0 g/L的两组在反应后期的处理效果比较相近，可能是因为制药废水成分复杂，含有多种微生物无法降解的有机物，当反应达到平衡后，出水 COD即为不可降解有机物的浓度。由于两者处理效果相差较小，反应中取最佳锰尾矿用量为2.0 g/L。

2.3 pH的影响

反应温度30 ℃，振荡速度170 r/min，接种量10%，锰尾矿用量为2.0 g/L，调pH分别为3，5，7和9，反应过程中废水COD与时间的关系见图5。

由图 5可知：pH对处理效果的影响并不十分显著，溶液呈酸性时处理效果不如碱性时好，pH在中性和碱性条件下，处理效果相近，考虑到进水 pH为 7左右，所以处理时可以不用调节pH。

环境pH变化时，微生物细胞膜等结构性质会发生变化，因而对其生长及代谢造成影响，同时细胞内酶的活性也受到影响，从而对微生物的活性造成影响。另一方面，Mn2+在不同pH溶液中的存在形式不同，Mn2+在酸性条件下可以溶解在溶液中，测定COD时，水样中Mn2+具有还原性，使COD测量值偏高。当溶液 pH达到中性至碱性时，Mn2+以 MnCO3等固态形式沉积在尾矿中，不会对水样造成二次污染。

图5 不同pH下废水COD浓度与时间的关系Fig. 5 Relationship between COD concentration and time under different pH

2.4 温度的影响

振荡速度170 r/min，接种量10%，锰尾矿用量为2.0 g/L，pH为7，反应温度分别为25，30，35和40 ℃，反应过程中COD与时间关系见图6。

由图6可知：在反应温度为25 ℃和40 ℃时，处理效果明显下降，而30 ℃时处理效果最好，所以最适宜温度取30 ℃。与pH对处理效果的影响原因相似，温度对微生物的活性有所影响，因为菌种分离自活性污泥，中温厌氧消化反应温度范围是30～38 ℃，所以菌种在此温度范围内活性最高，反应速率最快，过高或过低的温度，都会使菌体的活性下降，从而导致处理效果降低。

总结上述单因素实验结果，得到反应最佳反应条件为：反应温度30 ℃，振荡速度170 r/min，接种量10%，锰尾矿用量2.0 g/L，pH=7。由图6中30 ℃的数据可以看出：COD随时间延长先迅速减小，后趋于平衡，反应进行到第10天，COD去除率为84.7%，出水COD可由进水的282.6 mg/L降至43.2 mg/L，已达到化学合成类制药工业水污染物排放标准(GB 21904—2008)中特别排放限值的相关标准(ρ(COD)＜50 mg/L)，同时结合处理效果和运行成本等情况，反应时间取10 d。

图6 不同温度下废水COD浓度与时间的关系Fig. 6 Relationship between COD concentration and time at different temperatures

2.5 反应机理初探

在最佳反应条件下，进行接菌对照实验，每隔一定时间取样测定出水 COD(见图7)，讨论异化金属还原菌在废水处理中的作用。

图7 接菌和不接菌对照实验结果Fig. 7 Comparison of experimental results with or without inoculation

由图7可以看出：在反应开始的1 d内，两组实验中 COD的下降量基本相同，表明此时异化金属还原菌还未起作用，处理废水的主要作用是锰尾矿的吸附作用。第1天之后接菌组的COD开始迅速下降，至10 d以后基本达到平衡，而不接菌组的COD下降十分有限，在5 d左右甚至有回升的现象，至10 d以后才又缓慢下降。因此可知：从第2天开始，异化金属还原菌开始起作用，利用废水中有机物为底物进行反应，而不接菌对照组只存在吸附作用，物理吸附速率快，在1 d左右的时间达到饱和，后又发生脱附现象导致COD升高。

对异化金属还原菌处理废水的机理进行研究，在最佳反应条件下，定期测定溶液中Mn2+含量和固体中Mn2+含量，检测结果见图8。

图8 反应中Mn2+浓度变化Fig. 8 Changes of concentration of Mn2+ in reaction process

由图8可知：反应过程中总Mn2+的浓度先逐渐增加，后期趋于平衡，通过计算锰尾矿中MnO2的转化率可达95%以上。在厌氧条件下，微生物通过呼吸作用，将电子由有机物传递到锰尾矿，Mn4+得到电子被还原成Mn2+，有机物被微生物利用合成自身所需的能量，同时产生有机酸、CO2和水等[15]。溶液中 Mn2+含量在前6 d呈上升趋势，后又逐渐下降，固体中Mn2+浓度逐渐上升，这是因为溶液中Mn2+与CO32−结合生成 MnCO3，MnCO3在水中的溶解度很小，但溶于有机酸，因此反应前几天溶液中Mn2+浓度增加，随着反应的进行，有机酸进一步被微生物降解，生成的MnCO3逐渐沉积吸附在锰尾矿固体表面，造成溶液Mn2+浓度降低和固体Mn2+浓度升高。

微生物还原过程使锰尾矿的结构发生改变，反应前后锰尾矿粉末的扫描电镜见图9。由图9可知：反应前锰尾矿为粉末状，矿物粒径小，反应后矿物明显粒径增加，呈颗粒状，使其比表面积减小，提高了表面电子交换的能力[16]，生成的颗粒物相比粉末状态更容易从废水中沉淀分离。反应中起主导作用的是吸附生长在颗粒表面的微生物，这些细胞通过自身分泌的多糖类高分子物质互相连接，形成致密的生物膜[17]，从而加速反应的进行。

图9 反应前后锰尾矿扫描电镜图Fig.9 SEM images of manganese tailings before and after reaction

3 结论

(1) 从厌氧活性污泥中分离出异化金属还原菌，经过8 d的培养，Fe(OH)3被还原并生成Fe3O4，经过驯化后菌种已可以利用锰尾矿处理制药废水；

(2) 利用异化金属还原菌处理制药废水，最佳反应条件为反应pH=7，锰尾矿用量2.0 g/L，接种量10%，反应温度30 ℃，振荡速度170 r/min，经过10 d的反应，COD可由进水的282.6 mg/L降为43.2 mg/L，可达到GB21904—2008的相关标准；

(3) 异化金属还原菌利用锰尾矿处理制药废水的过程分为两个阶段，反应初期主要是锰矿的吸附作用，后期为异化金属还原菌参与的异化还原反应。

(4) 利用异化金属还原菌还原锰尾矿的同时处理制药废水，反应条件为厌氧，操作简单，易于管理，并可达到以废治废的目的，是一种新型的环境友好的废水处理方式。

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