白术多糖WAM-1结构的色谱分析和原子力显微镜观察

伍乐芹，姜绍芬，张 静

陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安 710062

白术多糖WAM-1结构的色谱分析和原子力显微镜观察

伍乐芹，姜绍芬，张 静*

陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安 710062

通过热水浸提法从草本植物白术根茎提取的水溶性粗多糖，经DEAE-52纤维素柱层析分离和Sephadex G-200凝胶过滤柱层析纯化，得到组分WAM-1。采用高效液相色谱(HPLC)检测WAM-1的纯度，气相色谱(GC)对其单糖组分进行分析，原子力显微镜(AFM)对其分子外貌进行观测。结果显示:WAM-1为均一多糖，由葡萄糖和半乳糖以3.01∶1摩尔比构成;在不同浓度溶液条件下，WAM-1分子以不同形态存在，多糖溶液的浓度对WAM-1的分子链构象及链间相互作用形式产生影响，推测可能与WAM-1分子内、分子间的氢键缔合作用有关。多糖浓度为10 μg/mL时，可清晰的观察到WAM-1是以刚性链状形态存在，且具有多分支结构。

白术多糖;分离纯化;原子力显微镜

白术(Atractylodes macrocephala Koidz)，别名云术、山姜、冬白术等，为菊科多年生草本植物。白术是我国常用的中药材之一，在中医临床上主要用于治疗脾胃虚弱、汗出、胎动不安等，白术的干燥根茎，性温味甘，具有健脾补胃、益气生血、燥湿利水等功效［1］。白术含挥发油、内酯、多糖等成分，其中白术多糖经研究发现具有抗氧化、提高免疫力、降血糖、抗肿瘤等生物活性［2］。白术多糖是否具有生物活性主要取决于多糖的物理性质、一级结构、高级结构和立体构型等［3］，因此，对白术多糖的构象研究具有重要意义。

原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)是通过微小探针与样品表面之间的相互作用来获得各种材料表面结构形貌信息的仪器。具有原子级高分辨率(纵向分辨率:0.1 nm)，可以在大气和液体环境下对各种材料和样品的纳米微区域进行观测。现已广泛应用于生物、化工、食品和医药研究中多种大分子链构象的分析研究［4］。AFM作为探索纳米级微观世界的有效手段，已经越来越多的被应用于多糖构象研究中［5，6］。本文采用DEAE-52纤维素层析柱和Sephadex G-200凝胶色谱对白术水提粗多糖进行分离纯化，获得均多糖WAM-1，并采用GC和AFM研究其单糖组分及分子形貌，同时探讨浓度对WAM-1多糖微观形貌的影响，为白术多糖的生物活性与构象关系的研究提供信息。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

白术，产地浙江，购于西安市中药材市场。

DEAE-52纤维素(Solarbio公司);Sephadex G-200(Pharmacia公司);D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖(sigma公司);其它试剂均为AR级。

Christ Alpha-4真空冷冻干燥机(德国 Marin Christ公司);SPM-9500J3型原子力显微镜(日本岛津公司);气相色谱仪(Agilent公司);高效液相色谱仪(Waters公司)。

1.2 白术多糖的提取、分离和纯化

白术粗多糖AM的提取方法参照文献［7］。取AM(100 mg)溶于蒸馏水(10 mL)，离心，上清液经DEAE-52纤维素柱层析初步分离，依次用蒸馏水、0.1、0.2 mol/L NaCl及0.3 mol/L NaCl溶液洗脱，流速为0.6 mL/min，DBS-100收集器进行收集，每管8 mL，苯酚-硫酸法检测，收集各组分洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥。主峰多糖组分为蒸馏水洗脱所得组分，命名为WAM。取WAM(30 mg)溶于蒸馏水(5 mL)，离心，上清液再经Sephadex G-200凝胶过滤柱层析纯化，蒸馏水为洗脱液，流速为0.3 mL/ min，每管收集3 mL，苯酚-硫酸法检测，收集洗脱液，冷冻干燥得到多糖WAM-1。

1.3 WAM-1的纯度鉴定

采用高效液相色谱法(HPLC)对WAM-1多糖进行纯度鉴定。称取WAM-1适量，配制1 mg/mL浓度多糖溶液，进行HPLC分析。色谱条件:Waters1525高效液相色谱系统，色谱柱为Shodex Ohpak SB-804 HQ，流动相为超纯水，流速为0.8 mL/min，Wtaers2410示差折光检测器，柱温30℃，进样量为20 μL。

1.4 WAM-1的单糖组分分析

称取WAM-1(5 mg)置于具塞试管中，加入2 mol/L三氟乙酸(TFA)，110℃水解4 h，取出后加入少量甲醇进行减压浓缩，重复3次，以除尽TFA，得水解产物。在水解产物加入0.5 mL吡啶，10 mg盐酸羟胺，2 mg肌醇六乙酰酯(内标)，置于90℃水浴锅中反应30 min，取出冷却至室温，再加入0.5 mL无水乙酸酐，于90℃水浴继续反应30 min，得糖腈乙酸酯衍生物［8］，之后进行GC色谱分析;以标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物作对照。色谱条件:程序升温，150～190℃，升温速率7.0℃/min，190～250℃，升温速率15℃/min;进样温度为280℃;检测器温度为260℃。

1.5WAM-1的AFM观测

将干燥的样品用去离子水溶解后，配成50、25和10 μg/mL溶液浓度梯度，置于磁力搅拌器持续搅拌4 h后，采用传统滴加沉积法将样品溶液滴在新剥离的云母表面［9］，室温干燥，放置于AFM上对其分子形态进行扫描观测。图像均在contact模式下获得，探针为Si3N4(微悬臂长:200 μm，弹性系数0.12 N/m)，原子力显微镜图像的形态学特征(如高度、宽度等)均采用原子力显微镜附带的软件进行分析。

2 结果

2.1 WAM-1的纯度鉴定

在WAM-1的HPLC谱图中，该多糖的吸收峰为单一狭窄对称峰，表明WAM-1为均多糖。

图1 WAM-1的高效液相色谱图Fig.1 HPLC of WAM-1

2.2 WAM-1的单糖组分分析

7种标准单糖的糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱图及保留时间(RT)见图2和表1。由图2可见，各峰分离较好，基本无干扰现象。在WAM-1的糖腈乙酸酯的气相色谱(图3)中出现3个峰，通过与标准单糖的气相色谱比照分析可知，1号峰为葡萄糖，2号峰为半乳糖，3号峰是内标峰。根据内标物的参比，由公式R1/2=f×(A1/A2)(其中f为校正因子，A为峰面积)计算得出，在WAM-1中葡萄糖和半乳糖的摩尔比为3.01∶1，说明WAM-1是一种由葡萄糖和半乳糖两种单糖以3.01∶1的摩尔比例构成的杂多糖。

图2 标准单糖的气相色谱图Fig.2 GC of mixed standard Monosaccharides

表1 标准单糖的保留时间Table 1 Retention time of standard monosaccharide

图3 WAM-1的气相色谱图Fig.3 GC of WAM-1

2.3 WAM-1的AFM观察结果

图4a和4b分别为50 μg/mL的WAM-1不同放大倍数的原子力显微镜图，可以看到，在疏水云母表面，WAM-1呈片状，球状等不规则形态，即使提高放大倍率，也没有清晰细节，不能获得多糖聚集体的微观形貌特征，这可能是由于多糖浓度过大，羟基数目多，分子间的氢键缔合作用强，多糖聚合较紧密，导致无法观察多糖真实形态。

图5a和5b分别为25 μg/mL的WAM-1不同放大倍数的原子力显微镜图，由图可见，WAM-1仍呈片状，提高放大倍率后，但可以清楚的看见片状中存在许多亮颗粒。通过和图4比较，可以推测，多糖浓度降低，羟基数目减少，多糖分子间的缔合作用减弱，有效的降低多糖的聚合程度，有利于观察多糖的真实形态。

图6a和6b分别为10 μg/mL的WAM-1不同放大倍数的原子力显微镜图，图6c为图6b的三维形态。从图中可以清晰地看到WAM-1以刚性分子链形态存在，且具有分支结构。利用原子力显微镜附带软件测得其单链高度在0.88～2.10 nm，宽度在51～110 nm范围，宽度可能是由探针的加宽效应造成的。

图6 WAM-1(10 μg/mL)的原子力显微镜图Fig.6 AFM images of WAM-1(10 μg/mL)

3 讨论

不同浓度WAM-1的原子力显微镜之间的区别表明，WAM-1分子间的相互作用和聚集度随着多糖浓度的增加而增大。当溶液中WAM-1的浓度较小时，多糖分子间的相互作用较小，分子比较分散，当多糖浓度增大至一定程度时，多糖分子间相互作用增强，形成聚集态。

图4和图5中，观察到WAM-1多糖的存在形态为大小不一，形态各异的聚集体。而图6中，可以看到清晰稳定的WAM-1多糖多分支的分子链结构。多糖的结构很复杂，包括一级结构、高级结构及空间结构等，要想得到更多的结构信息要配合使用其它的仪器分析方法和物理化学方法，如部分酸水解、高碘酸氧化、史密斯降解、NMR、GC-MS等，这样就能得出WAM-1主链及侧链的组成。本实验结果提示，在采用原子力显微镜观察多糖的微观形貌时，应注意样品的浓度。多糖样品的浓度会对其形态产生显著的影响，采用较高浓度的多糖溶液时，容易形成聚集体，而较低浓度的多糖溶液则可以避免聚集体的产生。如果浓度过大，可能影响大分子的形态，导致无法观察到多糖本身的结构。

1 National Pharmacopoeia Committee(国家药典委员会).Chinese Pharmacopoeia(中国药典)，Vol.Beijing:Chemical Industry Press，2005.68.

2 Cao G(曹岗)，Zhang XY(张晓炎)，Cong XD(丛晓东)，et al.The research progress of polysaccharides fromAtractylodes macrocephalaKoidz.J Beijing Union Univ，Nat Sci(北京联合大学学报，自然科学版)，2009，23:14-18.

3 Thulasi GP，Cherupally KN，Janardhanan KK.Polysaccharides isolated fromGanoderma lucidumoccurring in Southern parts of India，protects radiation induced damagers both in vitro and in vivo.Environ Toxicol Pharmacol，2008，26:80-85.

4 Zhao JW(赵健伟)，Wang N(王楠).Electricity characterization of metalloprotein at molecular level by conducting atomic force microscopy.Chem J Chin Univ(高等学校化学学报)，2005，26:751-753.

5 Liu RH(刘荣华)，Yang XF(杨小凡)，Chi AP(池爱平).Atomic force microscopy observation ofGynostemma pentaphyllumpolysaccharide GPPⅢ-a.Food Sci(食品科学)，2009，30:76-78.

6 Sun RG(孙润广)，Zhang J(张静).A study of helical structure of glycyrrhiza polysaccharide by atomic force microscopy.Acta Chim Sin(化学学报)，2006，64:2467-2472.

7 Li X(李昕)，Zhang J(张静).Optimization of the extraction water-soluble polysaccharides fromAtractylodes macrocephalaKoidz by orthogonal rotatable central composite design.Sci Technol Food Ind(食品工业科技)，2009，30:161-164.

8 Zhang WJ(张惟杰).Biochemical Techniques Study on Carbohydrate Compound(糖复合物生化研究技术).Zhejiang University Press，2003.38-40.

9 Wilkinson KJ，Balnois E，Leppard GG，et al.Characteristic features of the major components of freshwater colloidal organic matter revealed by transmission electron and atomic force microscopy.Colloids Surf A，1999，155:287.

Chromatographic Analysis and Atomic Force Microscope Observation of Polysaccharide Extracted from Atractylodes macrocephala Koidz.

WU Le-qin，JIANG Shao-fen，ZHANG Jing*
College of Food Engineering and Nutrition Science，Shanxi Normal University，Xi’an 710062

Polysaccharides extracted from the stem ofAtractylodes macrocephalaKoidz by hot water，were fractionated by DEAE-52 cellulose chromatography，and purified by Sephadex G-200 gel filtration chromatography to obtain a fraction，named WAM-1.HPLC and GC analysis showed that WAM-1 was a homogeneous and consisted of glucose and galactose in the molar ratio of 3.01∶1.The molecular morphology of WAM-1 was observed under an atomic force microscope (AFM).The results showed that WAM-1 existed in different forms with different concentrations.The concentration of polysaccharide had effects on the conformation and form of chain interactions，which might be related to the interaction of intramolecular and intermolecular hydrogen bonds.At 10 μg/mL，the morphology of WAM-1 was observed clearly in rigid chains with many branches.

polysaccharide;purification;atomic force microscope

R284.2

A

1001-6880(2012)05-0631-05

2010-10-15 接受日期:2011-04-22

国家自然科学基金项目(10874108);陕西省自然科学基础研究计划(SJ08A16)

*通讯作者 E-mail:zhangjin@snnu.edu.cn