辣根过氧化物酶在酚类废水中的应用

张丽华

（山西大同大学化学与化工学院，山西大同 037009）

辣根过氧化物酶在酚类废水中的应用

张丽华

（山西大同大学化学与化工学院，山西大同 037009）

辣根过氧化物酶（HRP）是一种重要的含血红素酶，具有结构特殊、酶源丰富、性质稳定、价格低廉等优点，在众行业中用途广泛。本文综述了辣根过氧化物酶的特性、作用机理及辣根过氧化物酶处理酚类废水的应用，并对现存问题和解决途径进行了探讨。

辣根过氧化物酶；酚类废水；废水处理

环境水污染的监控与治理是备受国内外研究者关注的课题，含酚废水又是当今世界危害最大的工业废水之一。酚类化合物种类繁多，有苯酚、甲酚、氨基酚、硝基酚、萘酚、氯酚等，这些都是有毒物质，有些有致癌、致畸以及突变的潜在毒性，一方面严重威胁着人类的健康与环境，另外对动物和农作物都有巨大的危害。含酚废水主要来自焦化厂、树脂厂、塑料厂、钢铁厂、合成纤维厂、纺织厂、煤气厂、石油化工厂、绝缘材料厂、加工林木长等工业部门以及石油裂解制乙烯、合成苯酚、聚酰胺纤维、合成染料、有机农药和酚醛树脂生产过程。由于含酚废水的组成、酸碱性以及浓度的不同，处理方法也不同，目前，工业中处理酚类废水的方法有物理法、化学法和生化法等三大类，其中包括焚烧法、活性炭吸附法、化学或酶氧化法、溶剂萃取法、微生物降解法等[1-2]。采用物理处理法对处理条件要求极高，而且设备昂贵；采用化学处理法容易导致二次污染；利用生物中的微生物降解酚类废水，则需要大规模培养微生物且耗时长，空间大，同时含酚废水对微生物存在毒害作用[3]。自1980年Klibanov等[4-5]首次将辣根过氧化物酶（HRP）用于处理酚类和苯胺类废水以来，用生物酶处理酚类废水的研究得到了广泛应用。很多工作者对此作出大量的研究，并证实用HRP处理工业废水中的酚类污染物具有高效性、反应条件温和且容易控制、能量要求低、受环境影响小等优点，是一种很有潜力的废水处理方法，因此，这一新兴的酶处理技术受到国内外大量研究者的关注[6-7]。

1 辣根过氧化物酶的简介

图1 植物辣根的早期图样

辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP广泛分布于植物界，辣根（图1）中含量最高。它是一种卟啉铁化合物，是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，中性糖和氨基糖约占18％，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。HRP由多个同工酶组成，其中以辣根过氧化物酶同工酶C（HRP C）的含量最为丰富，分子量约为44 000，等电点为pH 3～9，酶催化的最适pH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH=5左右。辣根过氧化物酶比活性高，稳定性强，分子量小，纯酶也较容易制备，而且这种酶含有血红素，能利用H2O2氧化许多有机及无机化合物，因此，辣根过氧化物酶具有广泛的商业价值。在临床诊断中可作为酶制剂和酶标记，藉以检验体液和组织内存在的多种疾病；还可用于电镜技术，酶联反应和免疫印迹等生物学研究，同时在生物传感器、木素降解、工业“三废”处理等方面也有大量应用。

2 辣根过氧化物酶的作用机理

辣根过氧化物酶属于氧化还原酶类，它能够以过氧化氢作为电子受体，专一地催化酚类和苯胺类物质的过氧化反应，这类反应属于双底物酶促反应，而且为乒乓双双反应机制。过氧化物催化氧化酚类化合物的反应机理如下[8]：

E+H2O→E1+H2O

E1+AH2→E2+·AH

E2+AH2→E+·AH+H2O

·AH+·AH→（AH）2

E代表酶，E1和E2是酶的中间体形式，分别称为化合物I和化合物II，AH2是酚类化合物，其中AH2为电子供体，常为芳香胺或酚类化合物，·AH代表其自由基。考虑到计量系数比的话，反应方程式为：H2O2+2AH2→（AH）2+2H2O

根据光谱学、动力学和晶体衍射的研究，辣根过氧化物酶具有独特的三维结构，这里我们以HRP C的结构作介绍，如图2[9]所示静态的HRPC含有两个不同的金属中心：正铁原卟啉环（FeIII）（常指血红素）和2个钙原子。这两个金属中心对于酶的结构完整性和功能完整性起到了必要的作用。从图3[10]可以看出，第一个轴向结合点是由血红素中铁原子和肽链上组氨酸170位侧链上的N原子结合的，而第二个轴向配体未被占用是为了酶在转化过程中提供给过氧化氢的。HRPC催化氧化酚类衍生物的机理如图4所示：催化循环开始于H2O2分子的异裂，第一步是由一分子HRP被H2O2氧化失去两个电子，此过程需要来自血红素的两个电子的转移，形成了一个水分子和化合物HRPI（氧化态为+V价）。HRP I此时以短暂的催化中间体形式存在，是血红素过氧化物酶催化反应典型的中间体，产生一个卟啉自由基阳离子[血红素（Fe4+=O）]。化合物I是不稳定的，它是一种强的氧化剂。催化循环的第二步由一分子还原性酚类底物的加入，生成另一个含有含氧Fe（IV）中心的催化中间体HRPⅡ。由于HRPI和HRPⅡ都具有高氧化态，所以都是强氧化剂，氧化还原电势约为+1 V。催化循环的第三步是再加入一分子还原性酚类底物，使HRPⅡ从第二个电子供体AH2上得到一个电子还原成静态酶。在静态酶中加入过量过氧化氢时，会使酶部分失活，这是由于生成了另外的一个催化中间体HRPIII，而中间体III又会引发另一系列的反应。HRPIII被认为是Fe（III）超氧化物与Fe（II）双氧化物的杂合体[11]。

图2 HRP C同工酶的三维结构图网状为血红素，球型为钙原子，螺旋型为α螺旋，尖头所指为β折叠

图3 HRP C中血红素连接区域的重要基酸残基

图4 HRP C催化酚类底物的机理

3 辣根过氧化物酶在酚类废水中的应用

Wagner等[12]人采用紫外分光光度计法，研究了辣根过氧化物酶催化氧化去除水溶液中酚类化合物的处理条件，还检测了添加剂聚乙二醇（分子量35 000）、壳聚糖、过氧化氢以及反应时间对HRP去除酚类化合物的影响；在同样条件下，还测定了其他的酚类化合物的去除效果，包括苯酚、2-甲酚、2，4-二氯酚、2-氯酚和4-氯酚。结果表明，3 h是最佳降解效果，而且在过氧化氢存在的情况下，辣根过氧化物酶在3 h内可除去约95％的酚类化合物。实验过程中发现添加了过氧化氢以后降解过程明显加速；同时也测得当添加剂PEG存在时，3 h后酚类化合物的去除效果较壳聚糖更好；对于其他酚类化合物的检测，发现21 h后酶反应完全时，苯酚、2，4-二氯酚、2-氯酚和4-氯酚的降解效果明显，但2-甲酚除外。总结出酚类化合物的去除效果主要取决于HRP和过氧化氢的比例。

郑琦等[13]人用辣根过氧化物酶催化处理邻苯二酚废水，结果表明，用辣根过氧化物酶可以有效地去除邻苯二酚。其最佳处理条件为：pH值为4.4，过氧化氢与邻苯二酚的摩尔比约2∶1，反应时间为30 min。实验测得适当增加酶用量可以明显缩短反应时间。

张国平等[14]采用高效液相色谱法研究了用HRP对五氯酚的模拟废水进行催化聚合处理地过程，结果表明，HRP可以有效的去除五氯酚。反应的最佳pH值为4～5，去除率可达95％以上。聚合处理过程中五氯酚与H2O2的反应计量比为2∶1。反应计量比及处理过程中氯的释放实验表明，五氯酚聚合作用的主要产物是二聚体。另外，反应速度与酶和H2O2的用量有关，增加酶用量或适量增加H2O2的用量，可以明显缩短反应时间。

蔡奕璇等[15]利用酶在微水溶剂中的“构象记忆”特性，以壳聚糖微球为载体，以辣根过氧化物酶为研究对象，将HRP于活性构象下冻干“固定”后，V二氧六环∶V水=99∶1微水介质中与载体进行共价交联，同时与传统水介质中共价交联固定化的HRP进行比较。结果表明，将1 g微水相固定的HRP和水相固定的HRP分别用于去除含量为2 mmol/L的苯酚，在相同条件下反应5 min后，微水相固定化HRP对苯酚的去除率可达到63.86％，而水相固定的HRP对苯酚的去除效率仅为34.16％；反应15 min以后，微水相固定化HRP对苯酚的去除效率已经达到最高，为84.9％，而水相固定的HRP在反应20 min后才达到最大值，去除率仅为72.51％。这表明了微水相共价固定化HRP在苯酚的去除中也更具优势。

Xu等[16]人利用电极酶催化氧化法，以磁性Fe3O4蚕丝蛋白纳米球为载体，以HRP为研究对象，制备了固定化HRP。检测了固定化HRP在一种无膜的电化学反应器上催化双酚A（2，2-双对羟苯基丙烷）的研究，并测定了pH值、反应温度、最适电压以及氧气流入速度对双酚A降解效果的影响和最适降解条件的选择。结果表明：当实际电压为1.6 V，HRP固定量为0.5 U/mL，pH=5.0，温度为25℃时，氧气流入速度为26 mL/min时，双酚A的去除率高达83％，远远超过其他方法。

王杉霖[17]等人采用了Fe3O4吸附包埋固定辣根过氧化物酶，并运用了明胶、开孔明胶、海藻酸钠3种不同的固定化载体。结果表明：最佳给酶量与Fe3O4用量比约为95 U HRP/Fe3O4g，Fe3O4用量与凝胶比例为1.0 g Fe3O4/10 mL 10％～20％，最适戊二醛浓度和交联时间分别为0.5％和30min。在此条件下制备的辣根过氧化物酶活性约为1.1U/g，酶活固定率约为15％，也证明了该固定化酶可以重复应用于五氯酚催化去除反应中，且可获得稳定的五氯酚去除率。所以，使用固定化酶同溶解酶的反应条件相似，但反应活性有所提高，且酶可以重复利用，因此这是一种有希望降低成本的酶法处理工业废水的新方法。

4 存在的问题及展望

随着工业的飞速发展，含酚类废水的排放也是日益严重，全球对其关注程度也日益增强。美国环保局从7万种有机物中筛选出65类129种优先控制污染物名单；我国环境检测总站也根据我国环境特征，提出了14类68种优先控制污染物黑名单，因此迫切需要具有各种专门的废水治理方法来降解其毒性。而利用生物酶的催化氧化作用来处理酚类、芳香胺类、染料类废水的污染是一种绿色的合成方法，是近年来受到国内外研究者重视的新方法，降解的结果有效地降低了有毒有机污染物的含量，同时也降低了毒性，是一种很有潜力的废水处理方法。辣根过氧化物酶是一种应用最为广泛的酶，因为其易于提取，价格相对低廉，而且性质稳定，耐热及与有机溶剂作用后活性也损失很少。生物酶相较于化学法，条件温和，专一性强，安全性高。但也有4点问题需要考虑：①很多酶法处理酚类废水的工作机理和环境因素尚未完全明确，结构变化与功能性质的关系也未被深入地研究，在这方面还有许多问题亟待解决；②考虑到生产成本和经济效益，游离酶在高温、强酸强碱等极端条件下易变性失活，严重限制了它的产业化应用，且酶是水溶性的，在酶促催化反应后不使酶变性而回收酶相当困难，所以使用固定化酶技术，必然会降低处理废水的成本，提高酶的使用效果，也必然会受到越来越多人的关注，在工业生产的各个方面有推广价值；③实际废水是一个十分复杂的混合体系，用单一酶处理，一般很难达到要求，因此，对于复杂的废水体系，是采用混合酶，还是单一酶分级处理，有待进一步探索，所以，实验室的研究与实际应用还有一段很大的距离；④考虑到酶的来源，毕竟天然酶的来源是有限的，相对于含酚废水的量而言，是远远不够的，所以，我们应该将天然酶发展到修饰酶、人工酶及超酶。

将非天然化合物的合成，作为酶工程今后发展的主要方向，使得酶具有更广泛的应用空间。相信随着科学技术的发展，人们将会在酶的应用领域取得更加具有实际意义的研究进展。

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Applications of H orseradish P eroxidase in the P henolic W astewater

ZHANG Li-hua
（School of Chemistry and Chemical Engineering，ShanxiDatong University，Datong Shanxi，037009）

Horseradish peroxidase（HRP）is an important heme-containing enzyme thathas been studied formore than a century.In recent years，HRP is recognized as themost versatile enzyme for applications of all kinds of fields due to its unique structure，its stability，plenty of source and low cost.The properties，mechanisms of catalysis and research progresses of Horseradish peroxidase in the treatment of phenols from wastewater were introduced significantly.The present problems and their solutions were discussed.So I think thatwe need to domore research in the field.

horseradish peroxidase；phenolic wastewater；wastewater treatment〔责任编辑 杨德兵〕

1674-0874（2012）03-0035-05

Q554+.6，X703

A

2011-10-02

张丽华（1981-），女，山西大同人，硕士，助教，研究方向：生物无机酶。