bFGF对拟血管性痴呆小鼠学习记忆障碍的保护作用

李春颖 曲 娴 张 笑

随着我国进入老龄化社会，血管性痴呆发病率仍在逐步上升，已成为严重威胁老年人生活质量的疾病，给社会和家庭带来了沉重的经济和精神负担。目前，对VD的发病机制尚未完全探明［1，2］、临床缺乏理想的治疗措施［3］，如何改善血管性痴呆患者的临床症状、明确发病机理，这些问题一直被人们广泛深入的研究。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是神经营养因子的一种，对神经元的存活、生长发育、分化、再生和功能维持具有不可替代的调节作用［4］。而碱性成纤维细胞生长因子是否能改善血管性痴呆学习记忆功能障碍，以及碱性成纤维细胞生长因子是如何改善其学习记忆功能障碍，目前尚未见报道。为此本课题采用清醒小鼠反复缺血再灌注制备VD动物模型，用bFGF对VD动物模型进行干预，观察其对模型小鼠的影响，揭示VD发病的部分机制，为bFGF防治VD的药物作用靶位提供基本素材，为临床实践提供理论和实验依据。

1.材料与方法

1.1 动物与试剂 昆明种雄性小鼠80只，体重30.0±3.12g。由长春高新区医学实验动物研究中心提供，合格证号:SCXK-(吉)2007-0008。bFGF注射液由Peprotech提供。

1.2 动物模型制备及治疗方法 将小鼠按体质量随机分为4组:正常组、假手术组、模型组、bFGF组，每组各20只。模型组和bFGF组:分离双侧颈总动脉，穿线，固定拉紧丝线阻断血流10分钟，松线使血液再灌注20分钟，反复3次，建立血管性痴呆动物模型。假手术组:只分离颈总动脉，套丝线扣，但不阻断血流。术后肌注青霉素0.2万单位/天，连续3天。正常组不作处理。bFGF组:建模后即刻腹腔注射bFGF(100μg/kg)，1次/天，连续7天。正常组、假手术组给予1ml生理盐水腹腔注射，1次/天，连续注射7天。

1.3 Morris水迷宫实验 建模后2周进行Morris水迷宫测试。采用Morris水迷宫视频跟踪分析系统，在直径80cm圆形水池中设置低于水面1cm透明站台，水温25±2℃，行为测试在安静环境内进行6天，前5天进行定位航行实验，将小鼠从东、南、西、北4个入水点背对站台轻轻放入水池，同时记录小鼠自入水到找到平台所需时间即逃避到平台上的潜伏期，每只小鼠重复4次，每次间隔30秒，以4次平均值作为当日最终潜伏期时间进入最后统计。如果小鼠在120秒内未找到平台，其潜伏期按120秒计算。第6天进行空间探索实验，将水迷宫中的平台撤出，小鼠从平台的对角线处放入，记录小鼠在平台所在象限的时间即穿越有效区的时间和120秒内穿越平台的次数。

1.4 冰盘上快速剖取脑组织 准确称量0.5g的右侧大脑组织，按组织重量体积比为1:9加预冷的生理盐水制成10%的组织匀浆，4℃ 3000rpm，离心10分钟，取上清液，储存-20℃冰箱备用，以牛血清蛋白为标准品，用考马斯亮蓝法测定各样品中蛋白质含量，按试剂盒说明书测定脑组织SOD、MDA含量。

2.结果

2.1 bFGF对拟VD小鼠Morris水迷宫的影响 与正常组比较，模型组小鼠寻找平台的潜伏期显著延长(P＜0.01)，穿越有效区的时间明显缩短，穿越平台的次数减少(P＜0.01)。经bFGF治疗后，寻找平台的潜伏期显著缩短(P＜0.01，表1)，明显延长穿越有效区的时间(P＜0.01)，增加穿过平台次数(P＜0.01，表2)。

表1 bFGF对拟VD小鼠寻找平台潜伏期(，s)

表1 bFGF对拟VD小鼠寻找平台潜伏期(，s)

注:与正常组比较，aP＜0.01;与模型组比较，bP＜0.01。

水迷宫测试第1天 第2天 第3天 第4天 第5天正常组 8 39.25±34.22 26.15±28.54 22.56±24.66 17.71±10.22 10.89±10.55假手术组 8 31.30±32.79 27.19±32.12 23.32±24.10 15.85±21.65 14.11±21.44模型组 9 62.12±45.33a 58.41±43.31a 46.36±40.88a 38.47±35.35a 36.94±32.38a bFGF组 8 33.27±26.68b 28.18±25.85b 25.28±27.52b 20.64±26.70b 15.37±13.29组别n b

表2 bFGF对拟VD小鼠空间探索实验的影响()

表2 bFGF对拟VD小鼠空间探索实验的影响()

注:与正常组比较，aP＜0.01;与模型组比较，bP＜0.01。

组别 动物数(n)穿越有效区时间(s) 穿越平台次数正常组 8 23.31±10.05 12.08±212假手术组 8 22.06±4.78 10.230±2.10模型组 9 12.01±2.50a 3.14±2.27a bFGF组 8 19.45±10.81b 8.75±2.43b

2.2 bFGF对血管性痴呆小鼠脑组织SOD活性、MDA含量的影响 与正常组比较，血管性痴呆小鼠脑组织SOD活性明显下降(P＜0.01)，MDA含量明显升高(P＜0.01)。而经bFGF干预，小鼠脑组织SOD活性明显升高(P＜0.01)，同时MDA含量降低(P＜0.01，表3)。

表3 bFGF对血管性痴呆小鼠脑组织SOD活力和MDA含量的影响(，n=10)

表3 bFGF对血管性痴呆小鼠脑组织SOD活力和MDA含量的影响(，n=10)

注:与正常组比较，aP＜0.01;与模型组比较，bP＜0.01。

组别 SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)正常组 97.22±7.88 17.57±1.28假手术组 96.90±6.86 17.06±1.50模型组 44.80±4.95a 29.67±1.95a bFGF组 72.47±5.61b 22.34±1.24b

3.讨论

反复性脑缺血是血管性痴呆的主要原因［5］。以往模拟血管性痴呆动物模型，主要采用血管阻断法，但其为单次脑缺血模型，且手术创伤较大、实验动物死亡率高，造成的记忆缺损呈可逆性。其他动物模型［6～9］也缺乏全面性和可靠性，都是从模拟人类血管性痴呆发病的某一侧面来完成的。本次实验采用清醒小鼠反复缺血再灌注，建立了血管性痴呆动物模型。

血管性痴呆小鼠在Morris水迷宫中被动回避反应能力和空间分辨能力下降，学习记忆功能明显受损。应用bFGF治疗后，小鼠穿越有效区时间以及穿越平台次数明显减少，表明bFGF对VD小鼠的空间学习记忆能力有明显改善作用。急性脑缺血和再灌注时，大量自由基产生同时伴有自由基清除酶功能降低，启动自由基连锁反应，加重脑缺血损伤［10］。本次实验显示，血管性痴呆小鼠脑组织MDA含量显著升高，SOD活力显著下降，这与既往研究结果相一致［11］。bFGF有助于模型小鼠脑组织清除自由基，提高机体的抗氧化能力，减少缺血再灌注引起的细胞功能的损伤。

本次实验提示bFGF能够改善血管性痴呆模型小鼠学习记忆能力，提高机体抗氧化能力，减少自由基对脑神经系统的损伤，但其具体机制仍有待于进一步的研究。

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