两种经口给药方法治疗实验性小鼠脉络膜新生血管的比较与评价

詹文捷唐由之江伟梁丽娜马群英李娇祁鑫张芸

两种经口给药方法治疗实验性小鼠脉络膜新生血管的比较与评价

詹文捷1，2唐由之1江伟1梁丽娜1马群英1李娇1祁鑫3张芸3

目的从药效药理学角度评价主动口服给药及灌胃给药的异同，为今后两种给药方法的选择提供实验依据。方法将氪激光诱导发生脉络膜新生血管的C57BL/6小鼠随机分为4组：灌胃治疗组，灌水对照组，饮药治疗组，饮水对照组，以正常小鼠作正常对照，不做任何处理。观察小鼠的一般情况，分别在治疗后第7天，第14天，第28天，采用ELISA检测外周血中的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量，并在治疗后28 d用FFA检查观察脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）面积。结果治疗过程中灌胃给药小鼠较主动口服给药小鼠体重偏低，精神及活动度稍差，毛色也较差；给药后第7天，14天，灌胃治疗组及饮药治疗组外周血的VEGF含量均低于相应的对照组及正常组（P＜0.05），灌胃治疗组和饮药治疗组之间比较无明显差异（P=0.179）；治疗后第28天行小鼠FFA检查，灌胃治疗组造影后期CNV渗漏面积明显小于灌胃对照组（P=0.033），饮药治疗组也明显小于饮水对照组（P=0.016），但2个治疗组之间无明显差异（P=0.701）。结论主动口服给药可以达到与灌胃给药相似的治疗结果，对体积小的动物以及需要长期给药的动物实验，主动口服给药也是一种有效的给药方法。

灌胃；主动口服给药；小鼠；脉络膜新生血管

临床上一些慢性疾病需要长期用药治疗，如高血压、糖尿病、癌症以及眼科的视网膜变性类疾病，因此相应的动物药效药理学研究也需要长期给药观察。经口给药是实验动物药理学最常见的给药方法，灌胃法因其给药剂量精确、可重复性强而被国内大多数学者采用，但是该方法存在操作技术要求相对较高，对动物刺激大、容易引起食管及胃损伤，甚至因为长期灌胃的应激反应影响观察指标等缺点，给研究者带来一定困扰。随着实验动物伦理学的发展，近年来国外动物实验采用主动口服给药方法（将药物加入饮用水或饲料中）逐渐增多，但是对不同经口给药途径的比较和评价研究很少，国内也未发现相关报道。本研究以实验性脉络膜新生血管小鼠做为观察对象，将外周血中的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量以及脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）面积作为评价指标，比较主动口服给药及灌胃给药的药效药理学差异，为今后2种给药方法的选择提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂

SPF级C57BL/6小鼠，雄性，体质量20～23 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。VEGF ELISA试剂盒（由北京优尼康生物科技有限公司提供），盐酸氯胺酮注射液（福建古田药业有限公司，0.1 g/支），盐酸赛拉秦注射液（华牧动物保健品有限公司，40 mg/1支），荧光素钠注射液（白云山明兴制药有限公司，0.6 g/支），复方托吡卡胺滴眼液（参天制药有限公司，10 ml/支）。明睛颗粒由生蒲黄，旱莲草等组成，其提取物由中国中医科学院中药所提供，相当于5.17 g生药/g。

1.2 主要仪器

高速离心机（BY600A），酶标仪（Rayto-RT6000），多波长氪激光机（lumenis novas variaXL），眼底造影机（Topcon 501X），Imagenet 2000图像分析软件。

1.3 造模与分组

1.3.1 动物造模：用盐酸氯胺酮（35 mg/kg）以及盐酸赛拉秦（5 mg/kg）的混合液麻醉小鼠，复方托吡卡胺滴眼液散瞳，眼前放置前置镜，经裂隙灯用659 nm激光机围绕视盘在血管之间光凝10点，光斑直径为50 μm，曝光时间为0.1 s，功率为180 mW，聚焦于Bruch’s膜，见到有气泡产生时提示Bruch’s膜被击破，为有效点，若出血或无气泡出现视为无效点。

1.3.2 动物分组及治疗：将120只造模成功的小鼠随机分为4组：灌胃治疗组，灌水对照组，饮药治疗组，饮水对照组，每组30只。灌药治疗组：2 g/ml明睛颗粒溶液灌胃，每只小鼠灌胃0.3 ml，每日1次，相当于0.6 g/（只·d）；灌水对照组：蒸馏水0.3 ml灌胃，每日1次。饮药治疗组：根据小鼠日平均饮水量3 ml，以明睛颗粒溶液取代饮用水让小鼠自行饮用，浓度为0.2 g/ml，相当于0.6 g/只/天；饮水对照组：正常饮用水喂养。30只未造模小鼠作为正常对照，正常喂养，不做任何治疗。

1.4 观察指标

1.4.1 一般情况观察：小鼠饮食、体重、皮毛、活动、精神状态等。

1.4.2 ELISA检测外周血VEGF的含量：分别于给药后第7天，第14天，第28天每组随机抽取10只小鼠，摘眼球取血。血标本离心30 min（3 000 r/min），取上清10 μl，按ELISA试剂盒说明书操作。

1.4.3 FFA观察CNV面积：给药后第28天每组抽取10只小鼠，按照前述方法麻醉及散瞳，腹腔内注射20%荧光素钠0.04 ml，行FFA检查，观察荧光素渗漏程度。采用Imagenet 2000图像分析软件测量各CNV的渗漏面积，取平均值比较。

1.5 统计方法

统计分析采用SPSS 13.0软件包进行统计分析，多组之间采用完全随机设计单因素方差分析，LSD法进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况观察

治疗过程中灌胃治疗组及灌水对照组小鼠体重偏低，精神及活动度稍差，2组因灌胃意外均死亡小鼠2只。饮药及饮水组小鼠与正常组相比体重无明显差异，精神及活动度好，毛色正常。

2.2 小鼠外周血VEGF含量比较

给药后第7天，灌胃治疗组及饮药治疗组外周血VEGF含量均低于其相应的对照组及正常组（P＜0.05）；灌胃治疗组值低于饮药治疗组，但两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。给药后第14天，各组VEGF值情况与给药7天后相似，灌胃治疗组外周血VEGF含量明显低于灌胃对照组（P=0.003），也明显低于正常组（P=0.002）；饮药治疗组外周血VEGF含量明显低于饮水对照组（P=0.000）；灌胃治疗组和饮药治疗组之间比较无明显差异（P=0.179）。治疗后28天，各治疗组与对照组之间VEGF值相比差异无统计学意义（P＞0.05），但各组值均低于正常对照组（P＜0.05）（表1）。

表1 各处理组小鼠用药后不同时间与空白对照组外周血VEGF含量的同期比较（±s，pg/ml）

表1 各处理组小鼠用药后不同时间与空白对照组外周血VEGF含量的同期比较（±s，pg/ml）

注：与灌胃治疗组比较，①P＜0.05，②P＞0.05；与饮药治疗组比较，③P＜0.05，④P＞0.05。第28天，各组与正常空白组比较，P＜0.05。VEGF：血管内皮生长因子（单因素方差分析，两两比较用LSD法）

12.25614.591 0.0000.000第7天第14天第28天样本量VEGF浓度样本量VEGF浓度样本量VEGF浓度正常空白组1095.89±22.85①③1095.89±22.85①③1095.89±22.85灌胃对照组10102.99±28.78①10106.32±23.27①1040.15±8.01②灌胃治疗组1059.53±11.421062.14±18.341050.75±7.57饮水对照组10110.88±6.60③10101.33±31.59③1054.06±9.64④饮药治疗组1077.30±16.96②1066.40±19.23②1055.10±15.99 F值P值组别3.935 0.01

2.3 小鼠眼底CNV渗漏面积比较

正常小鼠FFA表现：视网膜血管以视盘为中心呈放射状分布，脉络膜血管呈网状分布。模型小鼠FFA表现：光凝部位于动脉早期出现强荧光，造影晚期表现为荧光扩大增强。灌胃治疗组造影晚期CNV渗漏面积明显小于灌胃对照组（P=0.033），饮药治疗组也明显小于饮水对照组（P=0.016），但2个药物治疗组之间无明显差异（P=0.701）（表2）。

表2 各组眼底光凝小鼠治疗后28天FFA检查CNV渗漏面积比较（±s，μm2）

表2 各组眼底光凝小鼠治疗后28天FFA检查CNV渗漏面积比较（±s，μm2）

注：与灌胃治疗组比较，①P=0.033；与饮药治疗组比较，②P= 0.016。灌胃治疗组与饮水治疗组比较，P=0.701。CNV：脉络膜新生血管（单因素方差分析，两两比较用LSD法）

组别样本量CNV渗漏面积灌胃对照组85.036±1.63①灌胃治疗组82.86±0.88饮水对照组105.14±1.68②饮水治疗组102.99±1.35 F值3.826 P值0.019

3 讨论

实验动物药理药效学实验常用的经口给药方法包括主动口服给药法和灌胃法。主动口服法是将药物混入饲料中或溶于饮水中任动物自由摄取，灌胃法是指借助器械（灌胃针）将药物直接灌入动物胃内。一般认为灌胃给药能准确掌握给药时间、给药剂量，所以在药理药效实验中普遍采用。但是灌胃法除耗费时间较多外，还对动物造成一定程度的机械和心理的影响，技术不熟练容易造成动物的死亡，尤其是小体积动物以及需要长期用药观察的动物，若使用灌胃给药，会因为长期灌胃引起呼吸道损伤、胃膨胀，以及刺激肉芽组织发生。而且长期对小鼠暴力的抓取可能导致小鼠产生应激，引起动物生理性的一些改变，影响实验结果〔1〕。与灌胃法相比，主动口服给药方法简单，也不会因操作失误而导致动物死亡，因此，尽管此种方法存在给药剂量难以准确衡量等缺点，但随着实验动物伦理学的发展及一些需要长期给药的实验要求，其在动物实验中的应用将会逐渐增多。

年龄相关性黄斑变性属于慢性进行性疾病，临床治疗周期长，1个疗程多在3个月以上，给相关动物实验带来一定困扰，本实验从药效学角度探讨主动口服给药方法是否可以达到与灌胃给药相似的效果。实验所使用的“明睛颗粒”是国医大师唐由之总结的凉血化瘀方的颗粒剂，该方在临床上应用多年，对脉络膜新生血管相关疾病如老年性黄斑变性、特发性脉络膜新生血管（idiopathic choroidal neovascularization，ICNV）及病理性近视均显示出较好的疗效〔2-5〕；动物实验结果表明该方药可以抑制VEGF的表达〔5〕。我们在实验中发现，灌胃组小鼠饮食量减少，活动度及精神较差，并有因为灌胃时误入气管而出现意外死亡的情况。药效方面，明睛颗粒治疗后第7天、第14天，自动口服给药治疗组和灌胃治疗组小鼠的外周血VEGF含量均显著低于2个对照组，灌胃组VEGF值降低更为明显，但与口服给药组相比差异无统计学意义，提示2种给药方法对小鼠外周血VEGF含量的影响相当。从小鼠FFA检查结果也可看出，2种给药方法均可抑制CNV的形成及生长，疗效无明显差异。因此，从本实验的结果来看，口服主动给药也是一种有效的给药方法。

综上所述，本实验从药效学角度对2种经口给药的方式予以评价，发现主动口服给药也能达到相似的治疗结果。国外学者对主动口服给药方法予以改进，将药物与甜味剂混合后制成小药丸或果冻形式训练动物吞服，这样既避免了灌胃带来的副作用，又能保证定量给予〔6-8〕。所以，在一些动物需要长期给药观察，年龄小不适宜灌胃，或者灌胃者技术不熟练的情况下，我们可以考虑使用把药物加入食物或饮用水中让动物自行口服，从而减少对动物机体的刺激和伤害，保证实验的顺利进行。在下一步的研究中，我们将从血药浓度等药学角度探讨2种给药方法的异同，为今后动物实验给药方法的选择提供支持和帮助。

[1]De Meijer VE，Le HD，Meisel JA，Puder M.Repetitive orogastric gavage affects the phenotype of diet-induced obese mice[J].Physiol Behav 2010，100（4）：387-393.

[2]周尚昆，钟舒阳，王慧娟.唐由之研究员治疗湿性老年黄斑变性经验[J].辽宁中医杂志2011，38（1）：34.

[3]王慧娟，唐由之，巢国俊.凉血化瘀方治疗湿性老年性黄斑变性患者90例临床观察[J].中医杂志，2010，4（4）：316-318.

[4]王慧娟，唐由之.凉血化瘀方治疗湿性老年性黄斑变性研究[J].中国中医眼科杂志，2008，12（6）：322-324.

[5]唐由之，王慧娟，冯俊.凉血化瘀方对实验性脉络膜新生血管VEGF和PEDF表达的影响[J].眼科新进展，2009，12（29）：881-885.

[6]Atcha Z.Alternative method of oral dosing for rats[J].Am Assoc Lab Anim Sci，2010，49（3）：335-343.

[7]Goldkuhl R，Carlsson HE，Hau J，et al.Effect of subcutaneous injection and oral voluntary ingestion of buprenorphine on post-operative serum corticosterone levels in male rats[J].Eur Surg Res 2008，41（3）：272-278.

[8]Schleimer SB，Johnston GA，Henderson JM.Novel oral drug administration in an animal model of neuroleptic therapy[J].Neurosci Methods，2005，146（2）：159-164.

Comparing and evaluating the effect of two oral administration methods on experimental CNV mice

ZHAN Wenjie，TANG Youzhi，JIANG Wei，et al.Eye Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100040，China

OBJECTIVETo compare and evaluate the pharmacodynamic action of voluntary oral administration with intragastric gavage administration.METHODSC57BL/6 mice were induced CNV（choroidal neovascularization）by krypton laser and randomly divided into 4 groups:intragastric gavage control group，intragastric gavage treatment group，drinking water control group，drinking decoction treatment group.Ten normal mice were used as normal control without any treatment.The general state of health was observed.The VEGF（vascular endothelial growth factor）levels in peripheral blood were determined respectively by ELISA on day 7，14 and 28 after treatment，and the CNV leakage area was examined with FFA on day 28 of the treatment.RESULTSThe weights of mice in intragastric gavage groups were lower than that of the voluntary oral administration groups.And the spirit condition，the activity as well as the color pattern of the mice in intragastric gavage groups were also worse than that of the voluntary oral administration groups.The VEGF level in peripheral blood of the two treatment groups were significantly lower than that of its corresponding control groups and normal group on day 7 and day 14 after treatment（P＜0.05）.There were no significant differences between intragastric gavage groups and voluntary oral administration groups（P=0.179）.The CNV leakage area of FFA in the two treatment groups were significantly smaller than that of its corresponding control groups on day 28 after treatment（P＜0.05）.There was no significant difference between the intragastric gavage group and the voluntary oral administration group（P=0.701）.CONCLUSIONSVoluntary oral administration could have the same pharmacodynamic action as the method of intragastric gavage.For the long-term treating animal experiment or the experiment using tiny animals,voluntary oral administration method is an effective alternative.

intragastric gavage；voluntary oral administration；mice；CNV（choroidalneovascularization）

R-331

A

1002-4379（2012）04-0235-04

国家自然科学基金项目（81072846）

1中国中医科学院眼科医院，北京100040

2广州中医药大学

3中国中医科学院广安门医院

梁丽娜，E-mail：lianglina2001@hotmail.com