PEEK/HA复合材料热稳定性及细胞毒性试验*

倪卓 田生礼 王应 李文广 张琪瑶 苏瑶 黄民慧

PEEK/HA复合材料热稳定性及细胞毒性试验*

倪卓1田生礼2王应2李文广3张琪瑶1苏瑶1黄民慧1

目的 制备PEEK/HA生物复合材料，研究该材料的热性能和生物相容性。方法 在缩聚合成聚醚醚酮的基础上，与10%、20%、30%的纳米羟基磷灰石混合，制成聚醚醚酮/羟基磷灰石﹙PEEK/HA﹚生物复合材料。用热重分析法研究复合材料热稳定性。采用差示扫描量热仪﹙DSC﹚研究纳米羟基磷灰石对PEEK结晶动力学的影响。GFP、RFP荧光蛋白转化的大肠杆菌，与材料一起培养，观察材料对荧光蛋白表达影响。WST-1试剂盒检测该材料对Hela细胞毒性。结果 PEEK/HA复合材料热分解起始温度在500℃以上，热稳定性好。在加入20%纳米羟基磷灰石时，聚醚醚酮复合材料的结晶活化能﹙E﹚低，易于形成结晶。PEEK/HA复合材料对原核细胞和Hela细胞无明显毒性。结论 PEEK/HA生物复合材料的热性能和生物相容性良好。

PEEK/HA复合材料；热稳定性；结晶动力学；生物相容性

聚醚醚酮﹙PEEK﹚是一种半结晶性的热塑性材料，由于大分子链上含有刚性的苯环、柔性的醚键及提高分子间作用力的羰基，且结构规整，因而兼具热固性塑料的耐热性、化学稳定性和热塑性塑料成型加工性[1]。羟基磷灰石﹙Ca10﹙PO4﹚6﹙OH﹚2,HA﹚是一种无机材料，是人体骨组织中无机质的主要成分，大量的生物相容性试验证明羟基磷灰石无毒、无刺激、不致过敏反应、不致突变、不破坏生物组织[2]，因此具有良好的生物相容性，但是它的脆性较大，力学性能差。通过熔融共混的方法将HA加入到PEEK中可以制备具有一定生物活性的复合材料，HA加入量与复合材料力学性能存在重要关系，该材料作为骨移植材料具有较大的应用潜力[3-6]。

本文以对苯二酚与 4，4′-二氟二苯甲酮为原料，二苯砜为溶剂，在碳酸钠和碳酸钾催化下合成PEEK，在反应后期，分别将10%、20%、30%HA添加到PEEK中，高温条件下混合，制备PEEK/HA复合材料。采用热重分析法研究复合材料热稳定性。该材料热分解起始温度在500℃以上，热稳定性好。采用差示扫描量热仪﹙DSC﹚研究纳米羟基磷灰石对 PEEK结晶动力学的影响。在加入20%纳米羟基磷灰石时，聚醚醚酮复合材料的结晶活化能﹙E﹚低，易于形成结晶。荧光蛋白转化的大肠杆菌实验表明，PEEK/HA复合材料对原核细胞无明显毒性。真核细胞毒性试验显示，PEEK/HA复合材料对Hela细胞无毒性，对细胞生长有促进作用，生物相容性良好。

1 实验

1.1 实验试剂

4，4′-二氟二苯甲酮：纯度 99.5%，北京某公司提供；对苯二酚：纯度98%，上海某公司提供；二苯砜：上海某公司提供；无水碳酸钠：分析纯，汕头某公司提供；无水碳酸钾：分析纯，汕头市某公司提供；纳米羟基磷灰石：纯度97%，尺寸为70nm，南京某公司提供；环丁砜：大于99.9%，辽宁某公司提供；Hela细胞系：深圳大学生化与分子生物学实验室保存；DEME高糖培养基：某公司提供；胎牛血清：某公司提供；胰蛋白酶：上海某公司提供；E.coliJM109菌株：深圳大学生化与分子生物学实验室保存；pMBp-GFP和pMBp-RFP载体由吉坤美博士惠赠；琼脂糖G-10：GENE公司；胰蛋白胨tryptone：某公司提供；DNAMarker和DNA限制性内切酶HindⅢ：某公司提供；Tris·HCl、SDS和EDTA：上海某公司提供；氨苄青霉素：深圳某公司提供；WST-1试剂盒：苏州某公司提供。

1.2 PEEK/HA复合材料制备

准确称量对苯二酚，4，4′-二氟二苯甲酮（摩尔比 1﹕1），以二苯砜为溶剂，以碳酸钠和碳酸钾为催化剂，缩聚反应后，得灰色粘稠液体。将预热至250℃的环丁砜稀释剂缓慢加入反应器中，维持在300℃左右，搅拌均匀，加入纳米羟基磷灰石，半小时后，趁热迅速倾倒至常温蒸馏水中凝结分散，得灰白色块状固体。产物经粉碎机捣碎后呈粉末状，用丙酮和蒸馏水多次反复抽提、过滤，除去未反应的单体、溶剂和盐类杂质。在电热恒温鼓风干燥箱中100℃烘干12小时以上，最终得灰白色粉末样品[7]。羟基磷灰石在PEEK/HA中的摩尔比分别为10%，20%和30%。

1.3 PEEK/HA复合材料性能测试

使用日本日立公司的SectrumOneVersion B型傅立叶变换红外光谱进行红外光谱﹙FTIR﹚测试，扫描范围为4000cm-1～500cm-1，扫描次数为10次。使用德国的NETZSCH STA409PC型同步热分析仪进行热重分析，以Al2O3为参比物，试验在氮气气氛中﹙氮气流速30ml·min-1﹚进行，测量范围为300～700℃，将样品分别以10℃/min升温速率进行扫描，记录测量结果。用日本岛津DSC-60型差示扫描量热仪进行差示扫描量热测试，氮气氛围，先升温至410℃，并保持 10分钟以消除热历史，然后以 5℃，10℃，20℃，40℃的降温速率降温，记录数据并处理。

1.4 荧光蛋白转化大肠杆菌实验

将pMBp-GFP、pMBp-RFP载体转化至大肠杆菌，通过荧光蛋白的表达产生荧光现象检测PEEK复合材料对原核细胞是否有毒性。感受态细胞的制备：吸取 1.5ml培养好的E.coli JM109菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟，4℃下，4000rpm/min离心10分钟。弃去上清液，加入200ml预冷0.1mol/L的CaCl2溶液，用移液枪轻轻吹打均匀，在冰上放置10分钟。4℃下，4000rpm/min离心10分钟，弃去上清液，加入100ml预冷0.1mol/LCaCl2，轻轻吹打均匀，使细菌重新悬浮，细菌悬浮液用于转化实验。转化实验：取100 l感受态细胞悬浮液于Ependorf管中，加入10 l质粒，轻轻摇匀，在冰上放置20～30分钟，于42℃水浴中保温45秒～1分钟，然后迅速冰上冷却2分钟。向管中加入0.8ml LB液体培养基，摇匀后于37℃振荡培养约1小时。质粒酶切检鉴定：采用碱裂解法提取质粒，得到质粒 DNA，在Ependorf管中加入BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶反应体系，37℃水浴保温1小时，琼脂糖凝胶电泳，拍照。荧光蛋白表达：将转入 pMBp-GFP、pMBp-RFP载体的菌液滴入盛有PEEK、PEEK/10%HA、PEEK/20%HA样品的96孔板内，每孔接100 l菌液，加入0.5%的IPTG和1%的AMP，37℃培养30分钟。在荧光倒置显微镜下观察细菌在板上生长情况、拍照。

1.5 细胞毒性试验

从液氮中取出Hela细胞置37℃水浴中快速融化，低速离心﹙1000 rpm,5min﹚，去掉冻存管中培养液后加入新鲜的细胞培养液，37℃，5%CO2培养，复苏细胞。取0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，0.4%台盼蓝染液染色，计数板计数，将细胞浓度稀释成5×106个/ml。用96孔板分为A、B、C、D、E和F六组，A、B、C组为含实验材料组，分别放入PEEK、PEEK/10%HA、PEEK/20%HA三种材料﹙直径为0.6cm，高为0.2cm 的片状样品﹚，每组三个复孔培养。D、E、F组为空白对照组，2个复孔培养，接种200 l Hela细胞悬液于96孔培养板中，置于7℃，5%CO2培养箱中培养48小时后，用荧光相差倒置显微镜﹙X71,OLYMPUS公司﹚观察细胞形态和生长状况。将配好的WST-1溶液以每孔20 l的量加入，继续孵育3小时，用酶标仪于480nm检测。

2 结果与讨论

2.1 FTIR分析

图1为 PEEK和 PEEK/HA复合材料的红外光谱图。PEEK的红外光谱的特征吸收峰位置和形状与文献一致[7]，PEEK/HA复合材料红外光谱图中，包含了PEEK和HA的主要特征吸收峰，其中1850～1660cm-1处是 C=O基的伸缩振动，1095.27cm-1、962.67cm-1处的吸收是HA中PO43-的PO键的伸缩振动吸收，而564.19cm-1处的吸收则与P-O键的弯曲振动有关。没有明显的偏移或新峰出现。表明原HA与PEEK基体是物理结合，这样有利于HA与PEEK保持原有的生物特性，但不利于复合材料机械性能的改善。HA是在PEEK合成过程中加入的，该溶液状态下HA与PEEK混合分散性混合好，团聚较少。

图1 PEEK/HA复合材料红外谱图

2.2 PEEK复合材料热性能

PEEK/HA生物复合材料作为骨组织替代材料要求具备良好的热稳定性，在长期的机体环境中和成型过程中能够耐热和耐高温，性质稳定。在10℃/min升温速率条件下，PEEK/HA复合材料热失重性能数值，见表1。热稳定性能优异，该材料的起始分解温度在520℃左右。PEEK及三个复合材料的外推起始分解温度随着HA增加而逐渐降低，最大分解温度亦是如此。由于 HA含量增加导致在复合材料中，PEEK的含量减少，所需分解热量减少，进而呈现温度降低。随着HA含量的增大，样品最大分解速率逐渐降低，热分解速率有减慢的趋势，说明该复合材料热稳定性优于PEEK。

表1 PEEK/HA复合材料热失重数值

采用Kissinger[8]法研究HA对PEEK结晶活化能的影响，表2为PEEK/HA复合材料的结晶动力学参数，数据表明PEEK的结晶活化能为160.64KJ·mol-1，PEEK+10%HA的结晶活化能为161.74KJ·mol-1，PEEK/20%HA的结晶活化能为110.93KJ· mol-1。在加入20%纳米羟基磷灰石时，聚醚醚酮复合材料的结晶活化能低，易于形成结晶。因为纳米羟基磷灰石在聚醚醚酮结晶过程中起到成核剂作用和杂质作用，只有当HA适量时，成核作用显著导致结晶活化能降低。如果HA含量过高，成核作用不显著，过量HA导致PEEK结晶不完整，结晶过程困难，结晶活化能升高。

表2 PEEK/HA复合材料的结晶动力学参数

2.3 荧光蛋白转化大肠杆菌实验

pMBp-GFP、pMBp-RFP质粒转化大肠杆菌后，提取质粒进行双酶切鉴定。经1%琼脂糖凝胶电泳后，如图2所示，质粒经双酶切后分别出现两条带，其中一条在6000bp左右的带清晰明亮，为质粒。另一条是酶切下来的基因片段 GFP和RFP，分子量为750bp左右，与预期750bp大小一致，说明GFP/RFP质粒转化成功，大肠杆菌可以表达这两种荧光蛋白，细胞发出荧光现象表明PEEK复合材料对原核细胞没有毒性。

图2 质粒双酶切电泳图

选取绿色荧光大肠杆菌JM109/GFP作为观察对象。若菌液和材料样品相接处的荧光大肠杆菌死亡，则菌体内的GFP基因不表达；若菌体散发绿色荧光，则证明荧光大肠杆菌有活性。图3为材料旁细菌生长状态﹙B﹚、﹙C﹚、﹙D﹚中左上角为材料样品，发出的强烈的荧光。﹙A﹚、﹙B﹚、﹙C﹚、﹙D﹚四幅图中绿色荧光大肠杆菌均正常生长，菌体呈杆状，发出绿色荧光。证明荧光大肠杆菌存活，PEEK及其复合材料均无明显毒性，生物相容性良好。﹙彩图见插页﹚

图3 复合材料周围的大肠杆菌生长状态

2.4 细胞毒性检测

Hela细胞与材料共培养48小时后，观察细胞存活情况，见图4，细胞呈正常梭状形态，生长状况良好﹙彩图见插页﹚。加入WST-1试剂之后培养3小时后，取出材料，在酶标仪上检测各孔的吸光度值，计算平均值和吸光度比值，见表3、图5，将比值与1进行比较，若比值大于1，材料对细胞生长无抑制作用，相比较有促进细胞数量增长的作用，比值越大促进细胞生长的作用越大；若比值小于1，材料对细胞生长有抑制的作用，对细胞有毒性，比值越小对细胞毒性越大。该比值顺序为，PEEK/20%HA﹙1.35﹚，PEEK/10%HA﹙1.30﹚，PEEK﹙1.26﹚，说明了三种材料对Hela细胞均无毒性，PEEK/20%HA促进细胞数量增长能力要为明显。材料组OD值明显高于空白组，这种差异 ﹙<0.01﹚具有统计学意义[9]。随着羟基磷灰石加入量增加，复合材料对细胞数量增长作用更加明显[10]。羟基磷灰石有着优良生物相容性，促进了细胞数量的增长，提高了复合材料的生物相容性。

图4 Hela细胞在PEEK/HA复合材料培养基中生长状况

表3 材料组和空白组平均OD值比值表﹙<0.01﹚

表3 材料组和空白组平均OD值比值表﹙<0.01﹚

项目 样品孔平均值 空白孔平均值 样品平均值/空白平均值PEEK 3.17 2.52 1.26 PEEK+10%HA 3.28 2.52 1.30 PEEK+20%HA 3.40 2.52 1.35

图5 PEEK/HA复合材料平均吸光度值对比图

3 结论

本文研究了PEEK/HA复合材料的热稳定性，热分解温度在500℃以上，热稳定性良好。研究了纳米羟基磷灰石对PEEK结晶动力学的影响。在加入20%纳米羟基磷灰石时，聚醚醚酮复合材料的结晶活化能﹙E﹚低，易于形成结晶。PEEK/HA复合材料对原核细胞和Hela细胞均无明显毒性，生物相容性良好。

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PEEK/HA composite materials biocompatibility

Ni Zhuo1,Tian Shengli2,Wang Ying2,et al.1 College of Chemistry and Chemical Engineering Shenzhen University,Shenzhen Guangdong,518060;2College ofLife Science ShenzhenUniversity,Shenzhen Guangdong,518060,China.

ObjectiveTo prepare PEEK/HA composite materials,study the material thermal properties and biocompatibility.MethodBased on the polycondensation of polyether-ether-ketone,adding 10%,20%,30%hydroxyapatite blending into PEEK,prepared biological composite materials.Thermogravimetric analysis is to study thermal stability of the composite materials.By differential scanning calorimetry﹙DSC﹚the effect of HA on PEEK crystallization was studied.ResultsThe thermaldecomposition temperaturesareabove 500℃in starting,showing thermalstabilityisgood.The Crystallization activation energy of the composite materials is lower than that of PEEK.Cytotoxicity test shows that PEEK/HA compositeshaveno significant toxicity to prokaryotic cells and Hela cells.ConclusionThermal properties and biological compatibility of PEEK/HA composites is good.

PEEK/HA composite;Thermal stability;Crystallization kinetics;Biocompatibility

TB332

A

倪卓﹙1963-﹚男，教授，博士生导师。研究方向：高分子材料。

2012-05-11﹚

深圳大学应用技术开发项目（201223）；广东省大学生创新实验项目（1059012024）

1深圳大学化学与化工学院，广东深圳518060；2深圳大学生命科学学院，广东深圳518060；3深圳市人民医院，广东深圳518020