血必净对急性肺损伤兔模型中NF-κB信号通路的影响及其临床意义

赵容顺 单浩洪 吴伟鸿

1.广东省增城巿中医医院外科，广东增城 510000；2.广东省广州市第十二人民医院，广东广州 510620

急性肺损伤（ALI）是常见的急危重症。ALI的基本发生机制为细胞因子的过度表达及相互之间的复杂作用，使肺毛细血管通透性增加，液体、溶质和细胞成分迁移至间质及肺泡腔，产生肺水肿[1]。ALI目前尚无特异治疗方法，在众多细胞因子中，核因子-κB（NF-κB）调控多种细胞因子和炎症介质的转录表达，在ALI的发病过程中发挥着重要作用。本研究基于中医学理论及笔者的临床经验，结合现代医学研究进展，通过制备内毒素型急性肺损伤兔模型，观察中药制剂血必净注射液对ALI肺组织NF-κB的活性变化，探讨血必净注射液是否通过拮抗内毒素、抑制炎性介质释放和保护内皮功能等机制而发挥治疗作用，为中西医结合方法治疗ALI提供理论依据，提高抢救成功率。

1 材料与方法

1.1 材料

脂多糖、内毒素脂多糖（LPS）及试剂盒购自广州晶美生物技术有限公司（代理美国Sigma公司产品）。NF-κB的同源结合序列由北京奥科生物技术公司合成并行末端生物素标记。血必净注射液由天津红日药业股份有限公司提供，批准文号：Z20040033，每支10 mL。有效成分是由中药原料药红花、赤芍、川芎、丹参、当归中提取，其提取物的有效成分包括红花黄色素A、川芎嗪、丹参素、阿魏酸、芍药苷、原儿茶醛等。其中红花黄色素A浓度＞0.5mg/mL，芍药苷浓度＞1.0 mg/mL，阿魏酸浓度＞0.01 mg/mL。

1.2 动物模型及分组

1.2.1 分组 取新西兰兔80只（雄性），体重2.0～2.5kg，按随机方法分为四组：空白对照组、单纯急性肺损伤（LPS）组、单纯血必净（XBJ）组、血必净治疗（LPS+XBJ）组，各 20 只。

1.2.2 动物模型制作 1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔麻醉，经耳缘静脉注入内毒素LPS，制成急性肺损伤的动物模型。

1.2.3 干预方法 空白对照组给予生理盐水10 mL注射，LPS组仅注射 LPS 5mg/kg，XBJ组仅注射血必净 5mL/kg，LPS+XBJ组注射LPS 5mg/kg+血必净5mL/kg静脉注射。

1.3 观察指标及标准

1.3.1 血流动力学变化 通过生物多导仪观察实验前后血流动力学变化，包括呼吸频率、心率、体温、动脉和静脉氧分压、体重等，在所需观察时间内抽取血液标本。

1.3.2 动物模型制作成功的病理指标 LPS致伤后半小时处死动物，肺脏体积增大，表面可见大小不等的暗红色斑片状病灶，切面可有淡红或白色泡沫样液体溢出；光镜下观察，肺组织内有白细胞浸润，可见肺间质及肺泡水肿，肺出血明显。肺组织湿/干（W/D）比值明显升高。

1.3.3 肺组织病理形态变化 于12、24、36、48 h分批处死后分离肺组织后，取右肺组织进行组织切片在光镜、电镜观察病理形态变化。

1.3.4 NF-κB活性测定分离左肺组织，采用4℃生理盐水进行左肺灌洗，收集灌洗液，取摇匀的灌洗液原液1 滴，作细胞总数计数。灌洗液离心，细胞沉渣涂片做Wrigh-Giemsa染色，镜下分类，计数巨噬细胞、中性粒细胞（PMN），采用凝胶电泳迁延率法 （EMSA）加计算机辅助图像分析技术检测白细胞NF-κB活性（按试剂盒说明操作）。

1.4 统计学方法

使用SPSS 12.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，重复测量的计量资料采用方差分析，样本均数之间的两两比较用q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

与空白对照组比较，LPS组各时间点肺组织NF-κB表达量均明显增高（P＜0.01）；与LPS组相同时间点比较，LPS＋XBJ组24、36、48 h肺组织 NF-κB表达量明显减少（P ＜ 0.01）；与空白对照组比较，XBJ组各时间点肺组织NF-κB表达量有一定减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同组别各时期肺组织NF-κB含量比较（±s）

表1 不同组别各时期肺组织NF-κB含量比较（±s）

注：与空白对照组比较，P＜0.01；与LPS组比较，P＜0.01

组别 12 h（n=5） 24 h（n=5） 36 h（n=5） 48 h（n=5）空白对照组LPS组XBJ组LPS＋XBJ组42.7±12.8 207.5±87.2*41.5±11.3 185.2±84.8 41.9±11.5320.8±109.2*40.9±10.5121.2±59.2△42.3±13.2 408.3±102.5*39.1±9.8 92.7±42.8△42.5±12.5401.7±97.6*41.0±10.3 65.8±27.3△*△

3 讨论

既往临床报道显示，接近半数的脓毒症患者发生ALI，进而发展成为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），后者为脓毒症患者的主要死因之一。ALI发生时，肺组织中炎性因子大量表达，参与ARDS的发生发展。NF-κB是一组可被数百种上游因子激活的多效因子，其通过多条信号通路参与复杂的炎症反应。既往研究显示，NF-κB是脓毒症炎症反应的枢纽环节，其上游因子包括TLRs、TNF-α、COX-2 等，由于单纯下调某一上游因子并不能从根本上阻止ALI的进展，因此本研究选取NF-κB作为研究对象。

张克君等[2]向大鼠胰胆管逆行注入5%牛磺胆酸钠诱导ALI模型，结果发现肺组织NF-κB在6 h后开始增加，24 h增加最明显，而给予NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）的干预组，各时间点相应肺组织NF-κB含量明显降低，且NF-κB的下游因子PUMA表达水平亦明显降低，肺泡Ⅱ型细胞上皮凋亡明显较模型组轻。故他们认为NF-κB活化进而上调下游因子PUMA表达，促进肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡，而在ALI过程中发挥重要作用。本实验的结果显示，兔在注射LPS诱导ALI后，病程早中期NF-κB大量表达，至36 h达到峰值，随后逐渐平稳并出现降低趋势，提示在ALI的早中期，促炎反应占优势，而后期则转为抗炎反应占优势。由于ALI发展成为ARDS的根本原因在于内毒素可造成大量炎性介质释放，产生“瀑布”效应，促抗炎平衡随之被破坏。而NF-κB是ALI中发挥重要角色的因子，其在多条炎性通路中占据上游位置，阻断NF-κB的活化，就可能抑制肺组织细胞的凋亡过程，延缓ALI的发展。血必净是由丹参、当归、赤芍、川芎、红花五味中药经现代制药工艺提取其有效成分制成，主要成分为丹参素、芍药苷、阿魏酸、红花黄色素、川芎嗪等，既往动物实验及临床资料均显示血必净具有降低MODS死亡率的作用[3-6]。本次研究结果显示，血必净显著抑制了ALI兔模型的NF-κB表达，从而减轻了ALI，而未注射内毒素的XBJ组并未表现出NF-κB表达的明显抑制，提示血必净可能通过对内毒素的抑制作用阻断NF-κB的活化过程，而对正常机体的NF-κB信号通路无明显影响。

综上所述，血必净可通过下调ALI肺组织中NF-κB的表达水平，阻断其介导的炎症反应通路，抑制肺组织细胞的凋亡过程，而对正常肺组织中的NF-κB表达并无明显影响，具有显著的临床应用价值。血必净的具体作用机制及其是否对内毒素产生直接的抑制作用，尚需要进一步的实验研究证实。

[1] Maniatis NA，Kotanidou A，Catravas JD.Endothelial pathomechanisms in acute lung injury[J].Vascu Pharmacol，2008，49：119-133.

[2] 张克君，宋彩霞，焦学龙，等.NF-κB和PUMA与重症胰腺炎致急性肺损伤的关系以及PDTC的干预作用[J].中华急诊医学杂志，2010，19（9）：921-926.

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[4] 张景荣，张高峰，鞠萍，等.血必净治疗重症肺炎的临床研究[J].中国医药指南，2010，8（33）：86-87.

[5] 徐艺.血必净在重症肺炎治疗中的效果观察[J].中国当代医药，2011，18（25）：50-51.

[6] 刘清泉，梁腾宵，刘红旭，等.血必净注射液治疗脓毒症的多中心临床研究[J].北京中医，2007，26（1）：15-18.